The design and realization of synthetic pathways for the fixation of carbon dioxide in vitro

Die Fixierung von anorganischem Kohlenstoff und dessen Umwandlung in organische Moleküle bildet die Grundlage des Kohlenstoffkreislaufs und ist notwendig für das gesamte Leben auf der Erde. Seit der industriellen Revolution ist dieser Kreislauf jedoch gestört und als Konsequenz messen wir einen stetigen Anstieg der Konzentration an Kohlenstoffdioxid (CO2) in der Atmosphäre. Dieser Anstieg ist unteranderem einer der Hauptgründe für die Klimaerwärmung. Jedoch kann dieses CO2 auch als eine wichtige Kohlenstoffquelle der Zukunft betrachtet werden. Unsere Gesellschaft hat allerdings bis heute keinen optimalen Prozess gefunden, um dieses anorganische Molekül zurück zu gewinnen und ist weiterhin auf natürlich Prozesse angewiesen. Die Natur hat mehrere Stoffwechselwege evolviert, um CO2 zu reduzieren und wieder in organische Moleküle einzubauen. Diese Stoffwechselwege unterscheiden sich in den benötigten Cofaktoren und sind oft nur unter anaeroben Bedingungen funktionsfähig. Viele Versuche wurden bereits unternommen um diese natürlichen Prozesse zur Kohlenstofffixierung zu verbessern. Diese waren aber weniger erfolgreich. Die aufkommende Disziplin der synthetischen Biologie bietet einen neuen Ansatz, in dem komplett neue Stoffwechselwege zur Fixierung von CO2 entworfen werden. Solche künstliche Stoffwechselwege wurden schon in früheren Untersuchungen entworfen, aber keiner konnte bisher verwirklicht werden. Dies veranschaulicht eine bestehende Lücke zwischen dem Entwerfen von synthetischer CO2 Fixierung und dessen tatsächlicher Umsetzen und Anwenden. Ziel dieser Arbeit war es mehrere sauerstofftolerante und synthetische Stoffwechselwege zur CO2 Fixierung zu entwickeln, indem enzymatische Reaktionen kombiniert wurden. Das zentrale Enzym dieser künstlichen Prozesse stammt aus der Familie der Enoyl-CoA-Carboxylasen/Reduktasen, da diese zu den effizientesten Carboxylasen zählen, die bisher bekannt sind. Zudem besitzen sie keine Seitenreaktion mit Sauerstoff und benötigen für die Katalyse nur den ubiquitären Cofaktor NADPH. Die theoretische Analyse dieser neuen künstlichen Stoffwechselwege zeigte eine vergleichbare oder sogar bessere Energieeffizienz gegenüber natürlichen sauerstofftoleranten Prozessen zur CO2 Fixierung. Von diesen theoretischen Konstrukten, konnten wir zwei Stoffwechselwege in vitro realisieren und deren CO2 Fixierungseffizienz analysieren. Wir etablierten den Crotonyl-CoA/EThylmalonyl-CoA/Hydroxybutyryl-CoA (CETCH) and HydrOxyPropionyl-CoA/Acrylyl-CoA (HOPAC) Zyklus in vitro und optimierten deren CO2-Fixierungseffizienz in mehreren Schritten. In diesem Prozess wurden die Zyklen durch NADPH- und ATP-Regenerationssysteme mit Energie versorgt, Nebenprodukte wurden durch metabolische Korrekturmassnahmen recycelt und Enzyme wurden bearbeitet um gewünschte Reaktionen effizient zu katalysieren. Der CETCH Zyklus (Version 5.4) ist ein Reaktionsnetzwerk, dass aus 17 Enzymen besteht. Diese Enzyme stammen von neun verschieden Organismen aus allen Domänen des Lebens. Dieser Stoffwechselweg fixiert CO2 mit einer Rate von 5 nmol CO2 pro Minute und mg Enzym. Der HOPAC Zyklus (Version 4.1) hingegen besteht aus 15 Enzymen, die von acht verschiedenen Organismen stammen. Für beide Zyklen bestätigte die schrittweise Inkorporation von 13CO2 in die Intermediate, dass mehrere Reaktionsrunden aufrechterhalten werden konnten. Während der Entwicklung der künstlichen Zyklen zur CO2 Fixierung wurde unteranderem die Kristallstruktur der Methylsuccinyl-CoA Dehydrogenase (ein Schlüsselenzym in beiden Zyklen) gelöst. Diese gehört zur gut charakterisierten Familie der Flavin-abhängigen Acyl-CoA Dehydrogenasen. Wir klärten die Substratspezifität für (2S)-Methylsuccinyl-CoA auf, da es ein komplexes Substrat unter den Acyl-CoA Dehydrogenasen repräsentiert. Zusammengefasst legt diese Arbeit den Grundstein für die Entwicklung von künstlichen Stoffwechselwegen zur Fixierung von CO2. Die Resultate dieser Arbeit schmälern die Lücke zwischen theoretischem Entwerfen von künstlichen Prozessen für die CO2 Fixierung und deren Umsetzung in vivo. Der CETCH und HOPAC Zyklus erweitern die natürlichen Möglichkeiten zur Fixierung von CO2 um zwei Alternativen, die von Menschenhand geschaffen sind. Zudem sind diese thermodynamisch effizienter als der CBB Zyklus von Pflanzen.