Flavonolignan Biosynthesis in Silybum marianum – Potential Regulatory Mechanisms and Candidate Genes

Silymarin, ein Flavonolignangemisch aus der Mariendistel (Silybum marianum, Asteraceae), wird überwiegend zur unterstützenden Therapie von chron. Lebererkrankungen sowie zur Prävention tox. Leberschäden genutzt. Zusätzlich werden positive Effekte wie Tumorhemmung und immunmodulatorische Mechanismen beschrieben. Die Pflanze reichert Silymarin hauptsächlich in der Samenschale und Fruchtwand an. Dies dient zum Schutz des Keimlings gegen Pflanzenfresser und um Bakterien-, Pilz- oder Virusinfektionen einzudämmen oder zu verhindern. Der letzte Schritt im Biosyntheseweg von Silymarin ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Ausgangssubstrat ist die Aminosäure L-Phenylalanin, die zu 4-Cumaroyl-CoA umgewandelt wird, welches eine essentielle Vorstufe für die Synthese von Flavonoiden und Monolignolen ist. Ein Flavonoid (Taxifolin) und ein Monolignol (Coniferylalkohol) reagieren dann über Radikalbildung, Verknüpfung, Umlagerung und anschließendem Ringschluss zu Silymarin. Dabei entstehen mehrere Positionsisomere (hauptsächlich Silychristin, Silydianin, Silybin und Isosilybin), wobei die beiden zuletzt genannten als Diastereomerenpaare vorliegen. Die Verteilung der Regioisomere unterscheidet sich in Ökotypen/Kultursorten und Genotypen. Für die Radikalbildung ist sehr wahrscheinlich eine Peroxidase verantwortlich. Es ist nur sehr wenig darüber bekannt, wie die Differenzierung zwischen den Regioisomeren und Diastereomeren in der Pflanze abläuft, deshalb wurde eine mögliche Beteiligung von dirigierenden Proteinen untersucht. Aus Keimlingen dreier S. m. Varianten wurden in-vitro Kulturen angelegt, um zusätzliche Erkenntnisse über Gehalt und Zusammensetzung der Flavonolignane zu erhalten. Weiterhin wurde die Sekretion der Sekundärstoffe in Zellwand und Medium von Suspensionskulturen untersucht. Eine Kulturlinie wurde über einen zweiwöchigen Zeitraum in Bezug auf verschiedene Mediumskenngrößen, Silymarinbildung und entsprechende Enzymaktivitäten charakterisiert. Mit der gleichen Kulturlinie wurde auch eine Elicitierung durchgeführt. Obwohl eine geringe Zunahme an Silymarinkomponenten beobachtet werden konnte, sind die in Suspensionszellen von S. m. produzierten Mengen an Flavonolignanen leider sehr gering. Bemerkenswert dabei war ein Zusammenhang zwischen den einzelnen Positionsisomeren des Silymarins, extrahiert aus den reifen Fruchtschalen, und den entsprechenden in-vitro Kulturen. Die Zusammensetzung der Regioisomere in den Suspensionszellen hat Ähnlichkeit mit dem Chemotyp der Pflanzenherkunft. Dies untermauert die Annahme von genotypischen Variationen und eine mögliche Beteiligung regulatorischer Mechanismen. Erhöhte Taxifolinkonzentrationen in Enzymassays steigerten zwar die Bildung von zwei spezifischen Regioisomeren, weitere direkte Wege der Differenzierung konnten jedoch nicht gefunden werden. Da auch das Medium der Suspensionszellen Enzymaktivität und Flavonolignane aufwies, spielen vermutlich auch Transportsysteme eine Rolle. Durch molekularbiologische Methoden konnten eine sekretorische Peroxidase (Klasse III), eine Laccase der Cupredoxin-Familie und zwei dirigierende Proteine im Genpool von S. m. identifiziert werden. Die Expression dieser Gene in verschiedenen E. coli und Hefestämmen erwies sich leider als sehr schwierig. Diese Problematik wurde verstärkt durch die Anwesenheit von Signalpeptiden und mehreren Glykosylierungsstellen, welche wichtig für Aufbau und Funktion der Proteine sind. Für die Gewinnung rekombinanter Proteine wäre eine weitere Optimierung notwendig. Die an der Kopplungsreaktion zwischen Taxifolin und Coniferylalkohol beteiligen Enzyme konnten auch aus in-vitro Zellen und dem Medium gewonnen werden. Das verantwortliche Enzym konnte durch chromatographische Trennverfahren erfolgreich als Peroxidase mit einem Molekulargewicht von etwa 45 kDa bestimmt werden. Im Allgemeinen sollte sie in Struktur und Funktion der Meerrettich-Peroxidase (HRP) ähneln. Allerdings konnte dieses Protein allein nicht die Bildung einzelner Regioisomere des Silymarins gezielt steuern. Obwohl dirigierende Proteine auf genomischer Ebene nachgewiesen wurden, konnte ihre Gegenwart in Enzymextrakten oder ihre tatsächliche Beteiligung an der Bildung unterschiedlicher Silymarinkomponenten nicht belegt werden. Sie könnten organspezifisch oder zu verschiedenen Entwicklungstadien der Pflanze exprimiert werden. Eine Beteiligung nur während der Fruchtentwicklung und Reifungsphase wäre denkbar. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass im Rahmen dieser Arbeit Enzyme untersucht wurden, die vermutlich den letzten Schritt der Silymarin-Biosynthese katalysieren. Zahlreiche Faktoren wurden angesprochen, die möglicherweise die Zusammensetzung der Positionsisomere regulieren. Während die Expression der rekombinanten Proteine eine Herausforderung bleibt, wurden weitere Lösungsvorschläge vorgestellt. Eine Fortsetzung dieses Projektes scheint vielversprechend und hinsichtlich einer weiteren Aufklärung dieses Themas sehr interessant.