Structural Characterization of 17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 14 and Inhibitor Optimization Using Crystallography and Computational Techniques

Die 17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ 14 (17β-HSD14) ist des zuletzt identifizierte Subtyp der 17β-HSDs. In vivo oxidiert dieses Enzym die Hydroxyl-Gruppe von Estradiol (E2) und 5 Androstendiol (5-Diol) an Position 17 in Gegenwart des Kofaktors NAD+. Es existieren zwei Isoformen dieses zytosolischen Proteins, die sich ausschließlich in der Sequenzposition 205 unterscheiden: S205 und T205. Bis her wurde das Protein noch nicht gründlich und im Detail untersucht und seine physiologische Rolle ist noch unbekannt. Vor der Durchführung dieser Doktorarbeit war das 17β-HSD14 Apoenzym (S205) bereits kristallisiert worden. Die gelöste Struktur zeigt ein sehr weites und offenes aktives Zentrum sowie die konservierte katalytische Triade zusammen mit dem Rossmann-Faltungsmotiv. Jedoch waren alle C-terminalen Enden und bei einigen Ketten auch Aminosäuren der flexiblen Schleife (189-212) in dem funktionalen Tetramer nicht in der Elektronendichte definiert. Darüber hinaus ist es unmöglich, Informationen hinsichtlich eines potentiellen Substrats von dieser Apostruktur abzuleiten. Deshalb war die erneute Strukturbestimmung des 17β-HSD14 Apoproteins sowie seiner Komplexe mit Kofaktor und Substrat von größter Wichtigkeit. Nach erfolgreicher Etablierung der Expressions- und Aufreinigungsprotokolle für 17β-HSD14 wurden die beiden Isoformen (S205 und T205) biochemisch charakterisiert. Die Strukturen des S205 Apoenzyms und der binären Komplexe beider Isoformen mit NAD+ wurden aufgeklärt. In diesen Strukturen nimmt die flexible Schleife eine einzigartige geschlossene Konformation ein, die sich von der Apostruktur unterscheidet. Die Bindung des Kofaktors geht einher mit einer Verschiebung der flexiblen Schleife und des C-terminalen Tyr253’ des benachbarten Monomers, wodurch die Größe des aktiven Zentrums vermindert wird. Der ternäre Komplex des Enzyms mit Estron (E1) und NAD+ wurde ebenfalls aufgeklärt. E1 bindet auf untypische Weise in das aktive Zentrum, so dass sein A-Ring und nicht die enzymatisch modifizierte Position 17 nahe dem Nikotinamid-Baustein des NAD+ zu liegen kommt. Enzyminhibitoren sind nützliche Werkzeuge, um die Konsequenzen einer Enzymhemmung in vivo zu studieren. Dies erlaubt zu klären, ob dieses Enzym als neues Arzneistofftarget für bestimmte Krankheiten interessant sein könnte. Außerdem könnten potente und selektive 17β HSD14 Inhibitoren auch helfen, die Selektivitätsproblematik anderen 17β-HSDs zu verstehen. Da vor dieser Studie kein 17β-HSD14 Inhibitor bekannt war, war das Ziel die Identifizierung und Optimierung nicht-steroidaler 17β-HSD14 Inhibitoren. Dafür wurden 17β-HSD1 und 17β-HSD2 Inhibitorbibliotheken gegen 17β-HSD14 durdgemustert. Der vielversprechendste Treffer wurde als Startpunkt für weitere chemische Modifizierung unter Anwendung eines ligandbasierten Ansatzes verwendet. Neu entworfene Verbindungen wurden synthetisiert und anschließend auf ihre inhibitorische Aktivität gegen 17β HSD14 getestet. Vor dieser Doktorarbeit waren keine Strukturen einer humanen 17β-HSD im Komplex mit einem nicht-steroidalen Liganden veröffentlicht. Die Kristallstrukturen bestätigten, dass die Inhibitoren an die Substratbindestelle binden und ermöglichten die hohe Affinität dieser Inhibitoren zu erklären. Anschließen wurden zwei unterschiedliche Strategien zum Inhibitordesign verfolgt. Die ersten strukturbasierten Modifikationen des ursprünglichen Pyridin-Grundgerüstes führten zu 10 fach potenteren Inhibitoren. Das Ziel der zweiten strukturbasierten Optimierungsstrategie war die Erweiterung des zentralen Pyridin Kerns, um eine Interaktion mit der unbesetzten Tasche neben den Steroid-Ringen A und B zu gewährleisten. Der vorhergesagte Bindungsmodus wurde durch Kokristallstrukturen verifiziert und die niedrig-nanomolare Affinität durch biophysikalische Charakterisierung bestätigt. Die neuen Kristallstrukturen offenbarten, wie kleine Änderungen der Inhibitoren den eingenommenen Bindungsmodus beeinflussen. Die Charakterisierung der vielversprechendsten 17β HSD14 Inhibitoren bezüglich 17β HSD1, 17β-HSD2 und 17β HSD10 offenbarte unterschiedliches Ausmaß an Selektivität. Zusätzlich zeigten einige dieser Inhibitoren eine sehr niedrige Zytotoxizität und keine Wechselwirkung mit dem Multidrug-Resistance-Protein Pgp, was darauf hindeutet, dass diese Verbindungen nicht aus dem Gehirn ausgeschleust werden, was das Risiko möglicher Nebenwirkungen erniedrigt. Dies legt die Verwendung dieser Inhibitoren als Werkzeuge für weitere in vivo Untersuchungen nahe. Um die Selektivitätsprofile dieser Liganden hinsichtlich 17β HSD14 und anderen 17β HSDs zu erklären, führten wir einen strukturellen Vergleich durch. Die typische V-ähnliche Form der Bindetasche von 17β HSD14 wird durch His93 und Gln148 bestimmt; Aminosäuren, die in 17β HSD1, 17β HSD8 and 17β HSD10 fehlen. Zusätzlich haben diese drei Enzyme eine eher flache Bindetasche. Dies legt nahe, dass eine Anpassung an die charakteristischen dreidimensionalen Anforderungen von 17β-HSD14 und wahlweise die Adressierung von His93 und/oder Gln148 die Selektivität für diese Zielstruktur erhöhen werden. Solche Inhibitoren wurden durch Docking einer Bibliothek von 400 17β-HSD1 und 17β-HSD2 Inhibitoren mit GOLD vorhergesagt, gefolgt von einem in vitro Screening der Docking Hits und verwandter Verbindungen. Bemerkenswerterweise waren die vorhergesagten Bindemoden kaum Übereinstimmung mit den später ermittelten Kristallstrukturen, was auf die Anpassungsfähigkeit der Bindetasche durch die flexible Schleife zuruck zu führen ist. Schließlich wurde eine großangelegte röntgenkristallographische Fragment-Screening Kampagne durchgeführt, mit dem Ziel neue Inhibitor-Grundgerüste, die an 17β HSD14 binden, zu entdecken. Dies führte zu zwei Fragmenten die deutlich in der Elektronendichte zu identifizieren waren. Jedoch zeigten diese Fragmente keine signifikante Inhibition von 17β HSD14. Um ihre Affinität zu erhöhen, wurden Strategien zum Fragment-Wachstum und zur Fragment-Kopplung (growing und linking) aufgegriffen, was zu zwei neuen Inhibitoren mit gegenüber den Start-Fragmenten erhöhter Affinität führte. Zusammengefasst wurden beide Isoformen von 17β-HSD14, S205 und T205, biochemisch und strukturell charakterisiert, was zu vier neuen Kristallstrukturen führte. Die ersten beiden Klassen von Inhibitoren dieser Enzyme wurden entdeckt und gründlich charakterisiert. Zusätzlich wurden zum ersten Mal für diese Familie, die Strukturen von 12 nicht-steroidalen Inhibitoren im Komplex mit dem Protein ermittelt. Das Fragment-Screening durch die Bestimmung der Struktur von 96 mit Fragmenten getränkten Kristallen führte zu zwei Fragment Treffern, die erfolgreich optimiert und zu zwei Inhibitoren mit gegenüber den Vorgänger-Fragmenten erhöhter Aktivität entwickelt werden konnten.