Charakterisierung der an der Biosynthese des Cofaktors der [Fe]-Hydrogenase Hmd beteiligten Hcg-Proteine

Die [Fe]-Hydrogenase Hmd katalysiert die Reduktion von Methenyl-H4MPT+ zu Methylen-H4MPT unter Nutzung von H2 als Elektrondonor in der hydrogenotrophen Methanogenese. Die Produktion der Hmd war erhöht, wenn die Zellen unter Ni-limitierten Bedingungen kultiviert wurden. Hmd ist ein homodimeres Enzym, in dem die aktiven Zentren in einer Spalte zwischen den N-terminalen Domänen und den zentralen Domänen lokalisiert sind. Die N-terminale Domäne bindet einen Eisen-Guanylylpyridinol- (FeGP-) Cofaktor als prosthetische Gruppe. Der FeGP-Cofaktor besteht aus einem low-spin FeII, ligandiert durch zwei CO, einem Acyl-C und eine Pyridinol-N. Zusätzlich ist das Eisenzentrum durch ein Cys-S und ein Wassermolekül im Enzym koordiniert. Der Pyridinol-Ring ist mit einem GMP-Rest und zwei Methylgruppen substituiert. Genom-Analysen deuteten auf einen Cluster aus sieben konservierten Genen hin, der sowohl die hcgAG Gene als auch das hmd-Gen umfasst. Aufgrund dessen wurde angenommen, dass die hcg-Gene für die Biosynthese des FeGP-Cofaktors verantwortlich sind. Von den Gensequenzen selbst konnten jedoch keine Funktionen für die entsprechenden Proteine abgeleitet werden. Sowohl eine „Struktur-zu-Funktion“-Strategie, als auch biochemische Charakterisierungen wurden genutzt, um die Funktionen einiger Hcg-Proteine aufzuklären. In der vorliegenden Studie wird die Funktion von HcgC, anhand seiner Kristallstruktur und biochemischer Analysen beschrieben. Isotopenmarkierungen wiesen darauf hin, dass die C3-Methylgruppe des Pyridinol-Rings aus Methionin stammt und wahrscheinlich in einer S-Adenosylmethionin- (SAM-) abhängigen Reaktion übertragen wird. Strukturvergleiche zwischen HcgC und anderen verwandten Proteinen deuteten auf Ähnlichkeiten zu SAM-abhängigen Methyltransferasen hin. Co-Kristallisation von HcgC und SAM zeigte, dass SAM tatsächlich im aktiven Zentrum von HcgC bindet. Docking-Simulationen mit einem möglichen Methylakzeptor-Pyridinol zeigten eine wahrscheinliche Bindestelle für das Pyridinol auf. Das vorhergesagte Substrat-Pyridinolderivat wurde chemisch synthetisiert und die Enzymaktivität der HcgC wurde bestimmt. Die Struktur des Reaktionsproduktes der HcgC wurde mit NMR aufgeklärt und es wurde bestätigt, dass die Methylgruppe tatsächlich von SAM auf das C3 des Pyridinols übertragen wurde. Um den Katalysemechanismus näher zu untersuchen, wurde HcgC mit Pyridinol und SAM oder S-Adenosylhomocystein (SAH) co-kristallisiert. Es zeigte sich, dass sieben Wassermoleküle an der Bindung des Pyridinols im aktiven Zentrum beteiligt waren. Die einzige direkte Interaktion des Pyridinols und einer Aminosäureseitenkette war mit der Hydroxylgruppe von Thr179. Das C3 des Pyridinols lag in Nähe zum SAH-Schwefelatom. Die Kristallstruktur wies auf keine Aminosäure hin, die als generelle Base in der Reaktion hätte dienen können. Es wird vorgeschlagen, dass die koordinierenden Wassermoleküle die deprotonierte Form des Pyridinols über einen Resonanzeffekt stabilisieren, welcher die Nucleophilie des C3 erhöht. Mutationsstudien konnten die essentielle Rolle der Wassermoleküle in der Reaktion untermauern.