Phylogenetic, biochemical and structural assessment of key enzymes in ectoine and hydroxyectoine biosynthesis

In their natural habitats, microorganisms have to frequently cope with a multitude of stressful biotic and abiotic conditions that can have adverse effects on their growth and their survival in a given ecosystem. One of the most important parameters of environmental stress due to its impact on almos...

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Main Author: Widderich, Nils
Contributors: Bremer, Erhard (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2017
Subjects:
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Table of Contents: In ihren natürlichen Habitaten müssen Mikroorganismen regelmäßig eine Vielzahl biotischer und abiotischer Stressbedingungen, welche beeinträchtigende Effekte auf ihr Wachstum und ihr Überleben in einem gegebenen Ökosystem haben können, bewältigen. Aufgrund ihres Einflusses auf nahezu alle Mikroorganismen ist wechselnde Osmolarität/Salinität einer der wichtigsten durch die Umwelt bedingten Stressfaktoren. Unter Mikroorganismen ist die Akkumulation von kompatiblen Soluten eine weitverbreitete Anpassungsstrategie um die Zellintegrität und das Wachstum unter hyperosmotischen Bedingungen zu wahren. Die Tetrahydropyrimidine Ectoin und Hydroxyectoin sind solche Osmolyte und werden von vielen Prokaryoten synthetisiert um die beeinträchtigenden Auswirkungen hoher Osmolarität auf die zelluläre Physiologie zu minimieren. Aufgrund ihres positiven Einflusses auf Makromoleküle werden Ectoin und Hydroxyectoin in der Literatur auch als chemische Chaperone bezeichnet. Diese Eigenschaften haben Ectoine bereits für biotechnologische Anwendungsgebiete interessant gemacht. Ectoin wird enzymatisch durch die Ectoin-Synthase (EctC) synthetisiert und die Ectoin-Hydroxylase (EctD) katalysiert die Umwandlung von Ectoin zu Hydroxyectoin. Obwohl beide Enzyme bereits einigen wenigen Studien unterzogen wurden mangelt es an Detailwissen hinsichtlich ihrer phylogenetischen Verbreitung, Biochemie und Struktur, da nur eine kleine Zahl von EctC- und EctD-Proteinen vor dieser Dissertation charakterisiert wurde und Kristallstrukturen beider Proteine mitsamt aller gebunden Liganden noch immer fehlten. Da ein vertieftes Verständnis dieser Schlüsselenzyme in der Ectoin-Biosynthese sowohl hinsichtlich Grundlagenforschung als auch mit Blick auf deren industrieller Anwendungsbereiche erstrebenswert ist, war das Ziel der vorliegenden Dissertation die phylogenetische Verbreitung der Ectoin-Biosynthesegene zu taxieren und eine Selektion von EctC- und EctD-Enzymen hinsichtlich ihrer biochemischen und kinetischen Parameter zu studieren. Zusätzlich wurden von beiden Proteinen kristallographische Studien durchgeführt, um die Position und Bindemotive der verschiedenen Liganden in den katalytischen Zentren von EctC und EctD zu entschlüsseln. Diese wurden im Falle von EctD mittels gerichteter Mutagenese-Experimenten unterstützt. Um die phylogenetische Verbreitung der Ectoin-Biosynthese aufzuklären wurden die Aminosäure-Sequenzen beider Proteine als Suchanfrage genutzt, wodurch, nach Aussortierung redundanter Sequenzen, 723 potentielle Ectoin-Produzenten identifiziert werden konnten, von welchen lediglich 12 aus Archaeen stammten. Diese Analyse zeigte, dass die Ectoin-Biosynthese unter den Prokaryoten, und dabei überwiegend unter den Bakterien, weit verbreitet ist. Somit konnte die wichtige Rolle der Ectoine in der mikrobiellen Stressantwort unterstrichen werden. Auf dieser Grundlage wurden verschiedene Ectoin-Synthasen und Ectoin-Hydroxylasen, welche aus unterschiedlichen Organismen stammten und auf dem phylogenetischen Ectoin-Biosynthese Stammbaum weit verbreitet waren, biochemisch und/oder kinetisch charakterisiert. Jedes der studierten Enzyme wies ähnliche Enzymkinetiken auf, der Vergleich ihrer biochemischen Charakteristika offenbarte jedoch geringfügige Unterschiede zwischen den EctD-Proteinen und signifikantere Unterschiede innerhalb der EctC-Enzyme. Dies suggeriert, dass sich die Ectoin-Synthase, deren Eigenschaften partiell die Umweltbedingungen ihrer Wirte reflektiert, evolutionär vor der Ectoin-Hydroxylase entwickelt haben könnte. Die Identifizierung von EctC- und EctD-Proteinen, welche vergleichsweise erhöhte Stabilität aufwiesen, erlaubte zudem neue Kristallisationsversuche. Mehrere Kristallstrukturen konnten im Rahmen dieser Dissertation und in Kollaboration mit Dr. Sander Smits (Universität Düsseldorf) gelöst werden. Hinsichtlich EctD war es möglich Strukturen des Enzyms in seiner Apo-Form, in Komplex mit dem Eisenkofaktor, und in Komplex mit dem Eisenkatalyst, dem Kosubstrat 2-Oxoglutarat und dem Reaktionsprodukt Hydroxyectoin zu lösen. Diese Strukturen lieferten, in Verbindung mit umfassenden ortsgerichteten Mutagenesestudien, einen tiefen Einblick in das katalytische Zentrum von EctD und erlaubten eine Vorhersage für dessen katalysierten Reaktionsmechanismus zu treffen (Vorhersage von Dr. Wolfgang Buckel). Hinsichtlich EctC wurde ein detailliertes Expressions- und Reinigungsprotokoll von EctC aus Sphingopyxis alaskensis in Kollaboration mit Dr. Sander Smits (Universität Düsseldorf) beschrieben, das EctC als Dimer identifiziert und Kristallisationsversuche und vorläufige Röntgenstrukturanalysen-Daten abhandelt, welche eine vielversprechende Grundlage für die Auflösung der EctC Kristallstruktur schaffen, welche aufbauend auf diesen Daten, im Anschluss an die vorliegende Dissertation veröffentlich wurde. Zusammenfassend liefert die vorliegende Dissertation detaillierte Informationen über die phylogenetische Verbreitung und Biochemie der Schlüsselenzyme der Ectoin- und Hydroxyectoin-Biosynthese sowie die gelöste Kristallstruktur von EctD und vielversprechende Kristallisationsverusche von EctC und leistet somit einen substantiellen Beitrag zum Verständnis der Rolle von Ectoinen in der globalen mikrobiellen Osmostress-Anpassung.