Inhibitor Synthesis and Biophysical Characterization of Protein–Ligand–Solvent Interactions An Analysis of the Thermodynamics and Kinetics of Ligand Binding to Thermolysin

In der präklinischen Phase einer Wirkstoffentwicklung wird häufig die Affinität einer Verbindung im thermodynamischen Gleichgewicht in Form eines IC50, Kd oder ΔG° Wertes als Referenzparameter für ihre Effektivität als möglicher Wirkstoffkandidat verwendet. Einige der Faktoren, die auf molekularer Ebene zur Affinität einer Verbindung beitragen sind Wasserstoffbrückenbindungen, van der Waals Interaktionen, elektrostatische Wechselwirkungen, sowie hydrophobe Effekte. Mit Hilfe Struktur-basierter Methoden können diese Wechselwirkungen häufig den strukturellen Motiven eines Wirkstoffkandidaten zugeordnet werden. Dadurch kann die gezielte Konstruktion von Molekülen mit gewünschten Eigenschaften ermöglicht werden. Bindungsaffinität kann mithilfe des kinetischen Terms Kd als Quotient der Geschwindigkeitskonstanten von Dissoziation (kd) und Assoziation (ka) ausgedrückt werden. Der thermodynamische Ausdruck ΔG° lässt sich in einen enthalpischen (ΔH°) und einen entropischen Beitrag (–TΔS°) aufteilen. In beiden Fällen sind die molekularen Mechanismen, die die Bindungskinetik definieren oder zur Kompensation von Enthalpie und Entropie beitragen, nur unvollständig verstanden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist eine detaillierte Untersuchung der molekularen Prozesse, die die Interaktion von Proteinen und ihren Liganden ausmachen. Ein besonderes Augenmerk liegt dabei auf der Aufspaltung thermodynamischer und kinetischer Größen in ihre jeweiligen mikroskopischen Elemente. Hierfür wird die Metalloprotease Thermolysin (TLN) als Modellsystem verwendet. Dieses Protein ist gut charakterisiert und zeichnet sich daher als ein robustes Testsystem mit exzellenten kristallografischen Eigenschaften und einer bekannten Klasse von Inhibitoren aus. In der ersten Publikation (Kapitel 2) wird eine verbesserte Strategie für die Synthese und Aufreinigung von peptidischen Phosphonamidaten vorgestellt, die als potente Inhibitoren von TLN bekannt sind. Die inhärente Labilität der Phosphor–Stickstoff Bindung dieser Substanzklasse erschwert die Einführung polarer funktioneller Gruppen in das Inhibitor-Grundgerüst. Mit Hilfe einer neuen synthetischen Methode kann die Hydrolyse der Verbindungen während der Peptidkupplung, Entschützung und Aufreinigung durch die Verwendung einer Allyl-basierten Schutzgruppenstrategie und einer Festphasenextraktionsmethode auf ein Minimum reduziert werden. Dadurch wird die Darstellung von TLN-Inhibitoren mit einer Vielzahl funktioneller Gruppen in hoher Reinheit ermöglicht. Die zweite Publikation (Kapitel 3) befasst sich mit einer Methode für den Entwurf neuer Inhibitoren, die auf dem gezielten Design des einen Protein–Ligand Komplex umhüllenden Wassernetzwerks basiert. Basierend auf den Ergebnissen einer vorangegangenen Studie wird die Form eines hydrophoben Teils des TLN-Liganden solcherart verändert, dass eine begünstigte Stabilisierung von Wassermolekülen in der Hydrathülle des Komplexes ermöglicht wird. Unterstützt durch Molekulardynamiksimulationen wird eine Serie diastereomerer Inhibitoren synthetisiert und deren Bindungseigenschaften mittels Röntgenkristallstrukturanalyse, isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) und Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie (SPR) untersucht. Die Optimierung der apolaren P2‘-Gruppe des Inhibitors resultiert in einer 50-fachen Verbesserung der Affinität im Vergleich mit dem ursprünglichen Methyl-substituierten Liganden. Dieser Gewinn wird hauptsächlich durch einen vorteilhaften enthalpischen Term bedingt, der aus einer Stabilisierung polygonaler Wasserstrukturen in der ersten Hydratationsschicht entstammt. In der Folgestudie in Kapitel 4 wird die Binding einer Serie von Inhibitoren untersucht, die eine polare und geladene Gruppe in die Lösungsmittel-exponierte S2‘ Tasche von TLN platzieren. Eine terminale Ammonium-Funktionalität wird hierbei kontinuierlich tiefer in die hydrophobe Umgebung des Proteins gezogen. Die Untersuchung der Kristallstrukturen zeigt, dass die polaren Liganden, im Vergleich mit unpolaren Analoga, keine verstärkte Nahordnung in der umgebenden Wasserstruktur bewirken. Der Beitrag für die partielle Desolvatation der geladenen Gruppe in Kombination mit der Abwesenheit eines starken Wassernetzwerks hat einen empfindlichen Verlust an Bindungsaffinität, hauptsächlich bedingt durch einen ungünstigen enthalpischen Term, zufolge. Die tiefe, hydrophobe S1‘ Tasche von TLN bedingt die Substratspezifität der Protease und wird häufig von potenten Inhibitoren adressiert. Vorangegangene Experimente legen nahe, dass diese Bindetasche in Abwesenheit eines Interaktionspartners jedoch nur unvollständig hydratisiert ist. Die Studie in Kapitel 5 stellt eine experimentelle Untersuchung des Solvatationszustandes der S1‘ Tasche vor. Hierfür wird ein spezieller Inhibitor entwickelt, der die Proteintasche abdeckt. Die so entstandene Kavität bietet weiterhin genug Platz um die Bindung mehrerer Wassermoleküle zu ermöglichen. Die Analyse einer experimentell phasierten Elektronendichtekarte zeigt jedoch, dass die Kavität nicht solvatisiert, und somit vollständig leer ist. Vielversprechend für die Ausnutzung solch unvollständig hydratisierter Taschen für die Entwicklung neuer Arzneistoffe ist die Beobachtung, dass die Platzierung einer iso-Pentyl Gruppe in der P1‘ Position des Liganden eine dramatische, enthalpiegetriebene Erhöhung der Affinität um den Faktor 41.000 zur Folge hat. Eine detaillierte Analyse der Kristallstrukturen einer Serie von chemisch unterschiedlichen TLN-Inhibitoren ermöglicht die Untersuchung der Kinetik des Protein–Ligand Bindungsprozesses in Kapitel 6. Anhand der kinetischen Daten aus SPR Experimenten wird ersichtlich, dass die Art der funktionellen Gruppe in der P2‘-Position des Liganden einen erheblichen Einfluss auf die Dissoziationskinetik aufweist. Diese Eigenschaft kann auf die Interaktion der jeweiligen Funktionalität des Inhibitors mit Asn112, einer Aminosäure, die dafür bekannt ist, ein Substrat für die Peptidspaltung in der Bindetasche auszurichten, zurückgeführt werden. Die Seitenkette dieser Gruppe erfährt eine signifikante Konformationsänderung wenn das Protein aus seiner geschlossenen Form in die offene Konformation übergeht, aus der ein Ligand dissoziieren kann. Eine Beeinflussung dieses Mechanismus durch starke Wasserstoffbrückenwechselwirkungen zu einem Inhibitor führen zu einer Verlangsamung des Dissoziationsprozesses. Aus dem Fall des bekannten Inhibitors ZFPLA wird ersichtlich, dass eine zusätzliche Behinderung der Bewegung von Asn112 durch eine sterische Barriere in der P1-Position des Liganden die Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation um einen Faktor von 74.000 verringern kann. Die Fragment-basierte Suche nach neuen Leitstrukturen hat sich als eine potente Strategie für die Entwicklung neuer Wirkstoffe erwiesen. Die niedrige Affinität der Fragmente und die in den initialen Assays häufig verwendeten hohen Konzentrationen begünstigen jedoch das Auftreten falsch positiver Ergebnisse. Die Verfolgung einer solchen „falschen Fährte“ kann mit einem erheblichen Verlust von Zeit und Ressourcen verbunden sein. In Kapitel 7 wird die Affinität eines Moleküls, das in einem Fragment-basierten Screening gegen die Aspartylprotease Endothiapepsin als hochpotenter Binder aufgefallen war, als falsch-positives Ergebnis identifiziert. Umfangreiche Kristallografie-, HPLC- und MS-Experimente zeigen, dass die Bindungseigenschaften, die in mehreren unabhängigen Methoden detektiert wurden, tatsächlich einer anderen Verbindung zugeordnet werden können. Dieses Molekül wird aus der initial eingesetzten Substanz in einer Reaktionskaskade gebildet, die mit einer massiven Umlagerung des heterozyklischen Grundgerüsts einhergeht. Unterstützt durch quantenmechanische Berechnungen und NMR-Experimente wird ein Mechanismus für die Bildung der Verbindung postuliert und deren Bindungsmodus mittels Röntgenkristallografie aufgeklärt.