The species-specific effects of guinea pig adaptive mutations in Marburg virus VP40 and L on the protein’s functions and viral fitness

Das Marburg Virus (MARV) ist hochpathogen und verursacht häufig schwere oft tödlich verlaufende Infektionen in Primaten. In Nagetieren hingegen verursacht das MARV jedoch keine Erkrankung. Sequentielles Passagieren des MARV in Nagetieren führt jedoch zur Selektion von Virusvarianten die eine tödliche Erkrankung in Nagetieren hervorrufen. Lofts et al. konnten durch sequentielles Passagieren ein Meerschweinchen adaptiertes MARV etablieren, das sich vom wildtypischen MARV lediglich durch vier ausgetauschte Aminosäuren unterschied, für die Tiere aber tödlich war (Lofts et al., 2007). Eine, Mutation, D184N, befindet sich in VP40 dem viralen Matrix Protein und drei weitere Mutationen, S741C, D758A, A759D, befinden sich in der viralen RNA-abhängigen RNA Polymerase, dem L Protein. Die molekularen Mechanismen, die durch diese Mutation beeinflusst wurden blieben unklar. Ziel dieser Arbeit war es zu analysieren ob diese adaptiven Mutationen im Meerschweinchen-letalen MARV die Funktionen der Proteine VP40 und L in Meerschweinchenzellen im Vergleich zu menschlichen Zellen beeinflussen. Dazu untersuchten wir durch verschiedene Assays mit Hilfe von ektopischer Überexpression der rekombinanten Proteine VP40 mit der D184N Mutation und für verschiedene L Protein Varianten die jeweiligen Proteinfunktionen. Zusätzlich wurde der Einfluss der D184N Mutation in VP40 auf die replikative Fitness eines rekombinanten MARV bestimmt, welches lediglich die D184N Mutation in VP40 trägt (rMARVVP40(D184N)). Im ersten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt das rMARVVP40(D184N) spezifisch in Meerschweinchenzellen eine gesteigerte Fitness besitzt. Die viralen Transkription/Replikation war verstärkt, es fanden sich vergrößerten viralen Einschlusskörperchen in den infizierten Zellen und die Infektiösität von rMARVVP40(D184N) war spezifisch für Meerschweinchenzellen erhöht. VP40 ist ein multifunktionelles Protein, welches bei der Abwehr der Interferonantwort der Zelle sowie beim Zusammenbau und Abknospen der Viren und bei der Regulation von Transkription/Replikation beteiligt ist. Vergleiche der einzelnen VP40 Funktionen in humanen und Meerschweinchenzellen zeigten, dass die D184N Mutation den VP40-mediierten Interferon Antagonismus sowie die Assoziation von VP40 mit Zellmembranen nicht beeinflussten. Jedoch führte die D184N Mutation in VP40 zu einer Zunahme der Abknospung von VP40-induzierten virus-ähnlichen Partikeln (VLPs) in Meerschweinchenzellen. Zudem führte die D184N Mutation in VP40 zu einer Erhöhung der Menge an Nukleoprotein (NP) in infektiösen virus-ähnlichen Partikeln (iVLPs) lediglich in Meerschweinchenzellen. Diese Daten zeigen, dass viele der Funktionen des VP40 durch die D184N Mutation exklusiv in Meerschweinchenzellen beeinflusst werden und erklären zumindest teilweise die gesteigerte Infektiösität von VP40D184N enthaltenden iVLPs in Meerschweinchenzellen. Der bedeutendste spezies-spezifische Unterschied durch die D184N Mutation in VP40 betraf jedoch die VP40-vermittelten Inhibition der viralen Replikation und Transkription. Diese führte zu einer signifikanten Steigerung der viralen Replikation und Transkription in Meerschweinchenzellen was die Geschwindigkeit des Viruswachstums deutlich beeinflusste. Der zweite Teil dieser Arbeit untersuchte die Bedeutung der deri Mutationen im L Protein des Meerschweinchen-letalen MARV. Interessanterweise führte die S741C Mutation im L Protein zu einer deutlichen, spezies-unabhängigen, Steigerung der viralen Replikation und Transkription. Die Mutationen D758A und A759D hingegen hatten einen massiven Verlust der Polymerase Funktion des L Proteins zur Folge. Abschließend wurde durch Ko-expression der L Variante mit der S741C Mutation und VP40D184N gezeigt dass die Kombination dieser beiden Mutationen zu einer achtfachen Steigerung der viralen Replikation und Transkription in Meerschweinchenzellen gegenüber humanen Zellen führte. Die Daten dieser Arbeit, lassen vermuten, dass die D184N Mutation in VP40 und die S741C Mutation in L zu der hohen Letalität des Meerschweinchen-adaptierten MARV beitragen.