Applications of Fungal Prenyltransferases in the Chemoenzymatic Synthesis

Pflanzen, Bakterien und Pilze produzieren vielseitige primäre und sekundäre Stoffwechselprodukte. Beispiele der Sekundärstoffe sind Flavonoide, Coumarine, Xanthone und Indolalkaloide. Das Anhängen von Isopreneinheiten (n x C5), wie Dimethylallyl (DMAPP), Geranyl (GPP) oder Farnesyl (FPP) an aromatischen Grundstrukturen des Sekundärmetabolismus ist ein weiterer Schritt in der Diversifizierung dieser Stoffe. Die prenylierten Naturstoffe zeigen häufig stärkere pharmakologische Aktivitäten als ihre nicht-prenylierten Vorgänger. In der Natur wird die Übertragung der Prenyleinheit von Prenyltransferasen realisiert. Aus diesem Grund können Prenyltransferasen genutzt werden, um aromatische Substanzen zu modifizieren und somit neue biologisch aktive Stoffe herzustellen. Prenylierte Acylphloroglucinole (APs), die sich durch bemerkenswerte chemische Strukturen und verblüffende biologische und pharmakologische Aktivitäten auszeichnen, sind charakteristische Sekundärstoffe verschiedener Pflanzenfamilien. Wichtige Strukturmerkmale von prenylierten APs sind hoch oxidiert und dicht verziert mit Prenylgruppen, wie Dimehylallyl- und Geranyleinheiten. Phlorisobutyrophenone (PIBP), Phlorisovaerophenone (PIVP) und Phlorbenzophenon (PBZP) sind die Vorstufen der meisten prenylierten APs. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Akzeptanz der APs durch dreizehn pilzliche Prenyltransferasen in der Gegenwart von DMAPP untersucht. Neun regulär prenylierte Produkte wurden durch Einsatz von AnaPT erhalten. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass AnaPT dieselben Prenylierungen von PIBP und PIVP wie die membrangebundenen Prenyltransferasen, wie z.B. HIPT-1, katalysiert, welche in die Biosynthese von prenylierten APs in Pflanzen involviert sind. Die Umsatzrate mit AnaPT sind jedoch deutlich höher als mit HIPT-1. Allerdings wurden nur monoprenylierte Derivate in Gegenwart von DMAPP erhalten und die Umsatzraten von PIBP, PIVP und PBZP mit GPP als Prenyldonor waren sehr gering. Vor Kurzem wurde mit der pilzlichen Prenyltransferase AtaPT eine außergewöhnliche Promiskuität gegenüber diversen Arzneimittel-relevanten aromatischen Akzeptoren und Prenyldonoren, darunter DMAPP, GPP, und FPP, nachgewiesen. Daraufhin untersuchten wir das Verhalten von AtaPT gegenüber PIBP, PIVP und PBZP. Einundzwanzig prenylierte APs wurden isoliert und ihre Strukturen mittels NMR und MS aufgeklärt. Die Umsetzungen der drei APs wurden mit AtaPT und DMAPP bestimmt und waren deutlich höher als die mit AnaPT. Gleiche C-prenylierte Produkte wie AnaP-Reaktionen wurden identifiziert. O-prenylierte Produkte wurden aus den Reaktionen mit PIBP und PIVP erhalten. Auch Gem-diprenylierte Derivate konnten in den Reaktionsgemischen identifiziert werden. C-monoprenylierte Produkte wurden in Anwesenheit von DMAPP hauptsächlich zu gem-diprenylierte Derivate umgesetzt. GPP und FPP waren auch gute Prenyldonoren der AtaPT-Reaktionen. Nur ein einziges C-prenyliertes und ein O-prenyliertes Derivat konnten aus diesen Reaktionen identifiziert werden. Anschließend wurden Prenylierungen verschiedener Flavonoide, darunter Flavanone und Isoflavone durch AnaPT am C-6 des A-Rings und dem C-3´ des B-Rings untersucht. Zwölf prenylierte Flavonoide wurden in den Reaktionsgemischen von Flavonoiden und AnaPT in der Gegenwart von DMAPP produziert. Es ist bekannt, dass 7-DMATS Chalcone, Isoflavonoide und Flavanone deutlich besser als Flavone oder Flavonole akzeptiert und hauptsächlich die Prenylierung am C-6 katalysiert. AnaPT und 7-DMATS zeigen unterschiedliche Substratpräferenzen und Prenylierungspositionen. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden die für die Interaktion von FtmPT1 mit dem aromatischen Substrat Brevianamide F Schlüssel-Aminosäure Tyr205 identifiziert. Mittels Sättigungsmutagenese an dieser Position wurden Mutanten von allen übrigen 19 Aminosäuren hergestellt. FtmPT1_Y205N und FtmPT1_Y205L unterscheiden sich von FtmPT1 in ihrem Verhalten gegenüber den vier cyclo-Trp-Pro Isomeren. Regulär C2- prenylierte Derivate wurden als Hauptprodukte der FtmPT1 mit diesen Isomeren identifiziert. Dagegen waren revers C3-prenylierte Produkte die Hauptprodukte von Y205N und Y205L mit cyclo-D-Trp-D-Pro, cyclo-D-Trp-L-Pro und cyclo-L-Trp-D-Pro, während regulär C2- und C3-prenylierte Derivate mit cyclo-L-Trp-L-Pro nachgewiesen wurden. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die Isomere in unterschiedlichen Positionen und Orientierungen im aktiven Zentrum vorliegen und Tyr205 für die Reaktion zwar wichtig ist, jedoch durch andere Aminosäuren ersetzt werden kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass AtaPT und AnaPT vielversprechend Kandidaten für die Produktion von prenylierten APs, wie beispielweise -Bittersäuren im Rahmen der synthetischen Biologie sein können. AnaPT und 7-DMATS könnten komplementär für die Prenylierung der Flavonoide genutzt werden. Die Mutanten der FtmPT1 können für die Produktion von regulär C3-prenyliertem Brevianamid F in der synthetischen Biologie genutzt werden.