Systematic Correlation of Structural, Thermodynamic and Residual Solvation Properties of Hydrophobic Substituents in Hydrophobic Pockets Using Thermolysin as a Case Study

Wassermoleküle nehmen neben Protein und Ligand als zusätzlicher Bindungspartner an jedem in vivo Protein–Ligand Bindungsprozess teil. Die Verdrängung von Wassermolekülen von apolaren Oberflächen gelöster Moleküle in die umgebende flüssige Phase wird als treibende Kraft des hydrophoben Effekts angesehen. Die gängige Annahme ist, dass die Beweglichkeit der Wassermoleküle durch ihre Verdrängung erhöht wird, was einen Anstieg der Entropie zur Folge hat. Diese Erklärung, die auf Experimenten mit einfachen Modellsystemen beruht, reicht jedoch nicht aus, um den hydrophoben Effekt als Teil eines hochgradig komplexen Protein–Ligand Komplexbildungsprozesses zu beschreiben. So kann zum Beispiel die Verdrängung von Wassermolekülen von apolaren Oberflächen, die bereits vor der Verdrängung eine erhöhte Beweglichkeit aufweisen, zu einem enthalpischen Vorteil führen. Desweiteren muss berücksichtigt werden, dass durch die Bildung des Protein–Ligand Komplexes eine neue, zur Wasserphase hin exponierte Oberfläche ausgebildet wird, um die sich Wassermoleküle neu anordnen müssen. Diese Arbeit behandelt den Einfluss dieses Effektes auf die thermodynamische und kinetische Bindungseigenschaft eines Liganden. Um den Einfluss der Neuanordnung von Wassermolekülen um die Oberfläche eines neu gebildeten Protein–Ligand Komplexes auf das thermodynamische Bindungsprofil eines Liganden zu ermitteln, wurde eine homologe Serie aus neun Liganden, die an das Modellprotein Thermolysin (TLN) binden, analysiert. Die Protein–Ligand Komplexe wurden strukturell mittels Röntgenkristallographie und thermodynamisch mittels isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) charakterisiert. Der einzige strukturelle Unterschied zwischen den Liganden stellte deren strikt apolarer P2‘ Substituent dar, dessen Größe von einer Methylgruppe bis zu einer Phenylethylgruppe variiert wurde. Die P2‘ Gruppen adressieren die flache, apolare und gut solvatisierte S2‘ Tasche von TLN. Je nach gebundenem Ligand ändert sich die Form der wasserexponierten Oberfläche des Protein–Ligand Komplexes. Die ITC Messungen ergaben starke thermodynamische Unterschiede zwischen den einzelnen Liganden. Die strukturelle Analyse zeigte eine unterschiedlich starke Ausprägung der die gebundenen Liganden überziehenden Wassernetzwerke. Ein ausgeprägtes Wassernetzwerk korrelierte deutlich mit einem günstigen enthalpischen und einem ungünstigen entropischen Beitrag, und insgesamt mit einem Affinitätsanstieg. Auf diesen Ergebnissen aufbauend wurden zusätzliche P2‘ Substituenten rational entworfen mit dem Ziel eine stärkere Stabilisierung der angrenzenden Wassernetzwerke zu erreichen und dadurch die Ligandaffinität weiter zu erhöhen. Zunächst wurde die Qualität der putativen Wassernetzwerke mittels molekulardynamischer (MD) Simulationen validiert. Anschließend wurden die vorgeschlagenen Liganden synthetisiert, im Komplex mit TLN kristallisiert und thermodynamisch analysiert. Eine kinetische Charakterisierung mittels Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie (SPR) wurde ebenfalls durchgeführt. Die an die P2‘ Substituenten angrenzenden, kristallographisch bestimmten Wassernetzwerke entsprachen den Vorhersagen der MD Simulationen. Die Liganden zeigten ausgeprägtere Wassernetzwerke sowie eine leichte, enthalpiegetriebene Affinitätserhöhung im Vergleich zu den Liganden der ersten Studie. Der Ligand mit der höchsten Affinität zeigte ein nahezu perfektes Wassernetzwerk sowie eine signifikant reduzierte Dissoziationskonstante. Um den Einfluss der ligandüberziehenden Wassernetzwerke auf die kinetischen Bindungseigenschaften eines Liganden zu untersuchen, wurden 17 homologe TLN Liganden mit unterschiedlichen P2‘ Gruppen kinetisch mittels SPR und kristallographisch charakterisiert. Die Wassernetzwerkstabilisierung zeigte nur einen geringen Einfluss auf die Bindungskinetik. Im Gegensatz dazu erwies sich die Stärke der Interaktion zwischen Ligand und Asn112 als bestimmend für die Größe der Dissoziationskonstante. Eine starke Wechselwirkung führte zu einer deutlichen Verlängerung der Aufenthaltszeit des Liganden durch die Erschwerung einer konformativen Änderung von TLN, die jedoch notwendig für die Freisetzung des Liganden ist. In der letzte Studie wurde die Ursache für den außergewöhnlich großen Affinitätsanstieg bei einer Adressierung der tiefen, apolaren S1‘ Tasche von TLN mit apolaren Ligandgruppen untersucht. Dafür wurde eine homologe TLN Ligandserie mit unterschiedlich großen, apolaren P1‘ Gruppen (von einem Wasserstoffatom bis zu einem Isobutylrest) analysiert. Bereits der Austausch des Wasserstoffatoms an der P1‘ Position durch eine Methylgruppe führte zu einem 100-fachen Affinitätsanstieg des Liganden. Um den molekularen Mechanismus hinter dieser Affinitätssteigerung aufzuklären, wurde die S1‘ Tasche genau auf ihren Solvatationszustand hin untersucht. Die Ergebnisse sprechen deutlich dafür, dass die S1‘ Tasche komplett frei von Wassermolekülen ist. Die Affinitätssteigerung wurde deshalb auf das Fehlen eines energetisch kostspieligen Desolvatationsschrittes zurückgeführt. Die im Rahmen dieser Arbeit diskutierten Daten legen dar, dass für die thermodynamische Beschreibung des hydrophoben Effekts die Änderung des thermodynamischen Zustandes jedes einzelnen involvierten Wassermoleküls explizit berücksichtigt werden muss. Die alleinige Berücksichtigung der vergrabenen Oberfläche und die Zuweisung eines entropischen Beitrags ist nicht ausreichend. Die Erhöhung der Stabilisierung der Wasserstruktur, die angrenzend an einen proteingebundenen Liganden ausgebildet wird, stellt ein generelles und planbares — und vom Zielprotein relativ unabhängiges — Konzept dar, um das thermodynamische Profil eines gegebenen Liganden zu optimieren. Zu gewissem Maße kann dadurch auch Einfluss auf die Bindungskinetik genommen werden.