From Active-Site Mapping to Lead Discovery using Fragment-based Approaches on the Aspartic protease Endothiapepsin

Die Arbeit beruht auf der Auswertung und dem Vergleich verschiedener, fragmentbasierter Verfahren, für welche Zwecke das Modelprotein Endothiapepsin (EP) verwendet wurde. Das Enzym gehört zu der Familie der Aspartylproteasen, deren Vertreter in die Pathogenese schwerer Krankheiten wie Malaria, Alzheimer, AIDS, Bluthochdruck, und Pilzinfektionen involviert sind. Eine interne Fragmentbibliothek wurde verwendet, die 361 Fragmente enthält und die auf der Grundlage von physikalisch-chemischen Eigenschaften ähnlich der Astex rule-of-three basiert. Um diese zu durchmustern, wurden sechs verschiedene Screeningmethoden angewendet: Sättigungstransferdifferenz mit Kernspinresonanz (STD-NMR), thermal shift Assay (TSA), Reporterverdrängungsassay (RDA), Thermophorese (MST), ein fluoreszenzbasierter biochemischer Assay (HCS), und Massenspektrometrie (MS). Im Allgemeinen haben die RDA und HCS Assays eine vergleichbare Anzahl an Hits gezeigt (50 (RDA) gegenüber 56 (HCS)). Jedoch ist die Anzahl der Hits für die TSA und MS Assays drastisch geringer (25 (TSA) gegenüber 8 (MS)), obwohl die Gesamtzahl der verwendeten Fragmente in allen vier Assays sehr ähnlich war (325 (RDA), 358 (HCS), 330 (TSA), und 342 (MS)). Auffällig ist allerdings die geringe Überlappung der Hits, die von jeder der sechs Methoden detektiert wurden. Während nur 41 von 361 Fragmenten in der Bibliothekdatenbank von mindestens zwei Methoden detektiert werden konnten, waren es nur drei, die von fünf Methoden und kein einziges Fragment, welches von allen Methoden gleichzeitig detektiert wurde (Kapitel 2, Abb. 2.1). Aus diesem Grund wurde jedes der 361 Fragmente einzeln in apo EP-Kristalle diffundiert um mit den hieraus erhaltenen Daten eine Röntgenstrukturanalyse durchzuführen. Hierfür wurde eine sehr hohe Fragmentkonzentration von 90 mM verwendet. Interessanterweise konnten 71 gebundene Fragmente detektiert werden, was einer Hitrate von 20% entspricht. Auffallend war allerdings die Tatsache, dass nur 30% der 71 Hits von maximal einer der sechs zuvor durchgeführten Screeningmethoden detektiert werden konnten. Dies stellt deutlich heraus, dass jede Screeningkaskade, bestehend aus mindestens zwei Methoden, nur 19 (27%) der 71 kristallographischen Hits detektiert hätte. Dies hätte zur Folge gehabt, dass 73% der 71 kristallographischen Hits nicht als solche erkannt worden wären. Die Treffer wurden in zwei Hauptkategorien aufgeteilt: direkt- und fernbindende Fragmente. In Kapitel 3 wurden die Direktbinder behandelt. Dort wurde eine Vielzahl von Kopfgruppen beschrieben, die die katalytische Dyade entweder direkt oder über das katalytische Wasser W501 adressieren, während sie die S1 und S1‘ Bindetaschen besetzen. Darüber hinaus wurden Fragmente gefunden, die beide Bindetaschen gleichzeitig besetzen, was eine optimale Grundlage für Optimierungsstrategien in die benachbarten Taschen auf jeder Seite der katalytischen Aspartate bietet. Bindestellen abseits der katalytischen Dyade wurden in Kapitel 4 beschrieben. Die so genannten „hot-spots“ stellen wichtige Aminosäuren dar, die in einem Optimierungsprozess adressiert werden sollen, um optimale Ligandbindung zu erzielen. Das Durchsatzpotenzial der Röntgenstrukturkristallographie (Kapitel 3 und 4) verglichen mit den anderen sechs in Kapitel 2 beschriebenen Screeningverfahren, ist noch sehr gering. Es wird oft eine Mischung aus Verbindungen in Proteinkristalle diffundiert um die Hitidentifizierung zu beschleunigen. Dieses Verfahren können wir jedoch nicht empfehlen, da wir glauben, dass Parameter wie Löslichkeit, Reaktivität zwischen den Verbindungen, kompetitive Bindungsposen, und Kristallschäden durch die Mehrzahl an Verbindungen in einer Mischung stark beeinflusst werden. Probleme solcher Art sind in Kapitel 5 dokumentiert, in dem die Differenzelektronendichte zwischen einzeln gesoakten Fragmenten und Cocktails aus diesen direkt miteinander verglichen werden. Der einzig plausible Grund für die Verwendung mehrerer Verbindungen in einem Cocktail ist eine beabsichtigte Reaktion zwischen einzelnen Komponenten. Dieses Verfahren wird dynamische kombinatorische Chemie (DCC) genannt und in Kapitel 6 beschrieben. Als Verbindungen für die Mischung wurden Hydrazide und Aldehyde gewählt, die in einer Kondensationsreaktion zu Acylhydrazonen reagieren. Die Bildung der stärksten Liganden, die Acylhydrazone (S)-H4-A4 und (R)-H3-A5, wurde durch natürliche Selektion veranlasst, da das Zielprotein EP solche potenten Binder aus dem Mischungsgleichgewicht zieht. In einer Folgestudie erfolgte basierend auf den Bindungsmodi der zwei Acylhydrazone die Kombination von einem bis-Aldehyd mit Hydraziden und hieraus die natürliche Selektion eines bis-Acylhydrazones durch EP. Das auf diese Weise identifizierte bis-Acylhydrazon wies eine 240-fach höhere Affinität im Vergleich zu den ursprünglichen Acylhydrazonen auf, resultierend in einem zweistellig nanomolaren Binder.