Conditional Degrons to Study Gene Functions During Saccharomyces cerevisiae Gametogenesis and Proliferation

Diploide Saccharomyces cerevisiae Zellen können Sporen bilden, um Mangelbedingungen zu überdauern. Sporulation bezeichnet eine Zelldifferenzierung, bei der Meiose und Sporenbildung verknüpft sind. Eingeleitet wird die Sporenbildung beim Übergang in Meiose II an den Spindelpolkörpern, den Zentrosomenäquivalenten der Hefe. Eingebettet in die Kernmembran werden diese während der Meiose zweimal durch einen vorwiegend konservativen Mechanismus verdoppelt. Daraus resultieren drei Generationen von Spindelpolkörpern in Meiose II: Der erste stammt aus dem vorangegangenen Zellzyklus, der zweite wird während der meiotischen Prophase gebildet und die dritte Generation entsteht vor Eintritt in die zweite meiotische Teilung. Zu Beginn der Meiose II formen sich an den zytoplasmatischen Plaques der Spindelpolkörper die sogenannten meiotischen Platten. Diese ermöglichen die Bildung der Prosporenmembranen, welche um die Ausstülpungen des Kerns herum wachsen und sich nach Zusammenbruch der Meiose II-Spindeln schließen. Die Sporenwand wird anschließend im Lumen der entstandenen Doppelmembran aufgebaut. Zuletzt kollabiert die Mutterzelle um die Sporen und formt den Ascus. Hefezellen sind in der Lage entsprechend der Nahrungsbedingungen Asci mit weniger als vier Sporen zu bilden indem sie weniger Proteine der meiotischen Platten produzieren. Ermöglicht wird diese Regulation durch die Polarität der Meiose II-Spindeln, durch welche meiotische Platten bevorzugt an den jüngeren Spindelpolkörpern geformt werden. Dieser Prozess stellt sicher, dass Asci mit nur zwei Sporen keine Schwesterchromatiden enthalten und trägt damit entscheidend zur Aufrechterhaltung der genetischen Vielfalt und Überlebensfähigkeit einer Population bei. Dennoch ist wenig über den zugrundeliegenden Mechanismus bekannt. In dieser Arbeit habe ich verschiedene synthetische Methoden entwickelt, um den Einfluss des „Mitotic Exit Networks“ (MEN) auf meiotische Spindelpolarität und Sporenzahlkontrolle zu erforschen. Das MEN ist ein konservierter Signaltransduktionsweg, der essentielle Funktionen während des vegetativen Wachstums erfüllt indem er die Aufteilung des Genoms mit der Zytokinese koordiniert. Außerdem kontrolliert er die Ausbildung der mitotischen Spindelpolarität während der Metaphase. Die Funktionen des MEN in der Meiose sind weitgehend unbekannt, da es an verlässlichen Methoden zur Herstellung von sporulationsspezifischen Mutanten mangelte, die nötig gewesen wären, um die für den Zellzyklus essentiellen Komponenten des MEN zu untersuchen. Zur Lösung dieses Problems habe ich zwei verschiedene Ansätze zur Kontrolle der Proteinmengen durch konditionale Degradationssequenzen (Degrons) gewählt. Erstens wurde ein photosensitives Degron etabliert, welches auf der Fusion eines synthetischen C-terminalen Degrons an die LOV2 Photosensor-Domäne des Phototropin 1 aus Arabidopsis thaliana basiert. Im Dunkeln ist das Degron maskiert während konformationelle Änderungen der LOV2-Domäne unter Blaulicht zur Aktivierung des Degrons und Abbau des markierten Zielproteins führen. Zweitens wurde ein bestehendes System zur Protein-Destabilisierung weiterentwickelt, welches die Tabak-Ätz-Virus-Protease verwendet, um ein geschütztes Degron zu aktivieren. In vorangegangenen Arbeiten ermöglichte die Regulation der Biosynthese dieser Protease durch einen meiosespezifischen Promotor die Aufklärung von Proteinfunktionen während der Sporulation. Zur Entwicklung eines effizienteren Systems habe ich zwei parallele Strategien verfolgt: Durch gerichtete Evolution wurde eine Variante der Protease erzeugt, welche durch eine verringerte Substratspezifität die Verwendung potenterer Degrons zulässt. Davon unabhängig habe ich eine meiosespezifische Deaktivierung der Zielgenexpression kombiniert mit einer Steigerung der Proteaseproduktion während der Sporulation. Dieser Ansatz konnte erfolgreich genutzt werden, um meiosespezifische Mutanten aller wesentlichen Komponenten des MEN zu erzeugen. So konnte gezeigt werden, dass dieser Signalweg die altersabhängige Entscheidung beeinflusst, an welchen Spindelpolkörpern meiotische Platten gebildet werden. Außerdem fand ich eine funktionelle Diversifizierung der MEN Komponenten während der Sporulation. Die vorgelagerte Kinase Cdc15 trägt zur Regulation der Anzahl von meiotischen Platten und der Schließung der Prosporenmembranen bei. Für die Spindelpolkörper-Auswahl zu Beginn der Meiose II sind sowohl Cdc15 als auch die nachgelagerten Komplexe aus Dbf2 bzw. Dbf20 und Mob1 notwendig. Nach den meiotischen Teilungen werden diese Komplexe für den Aufbau der Sporenwände und damit eine zuverlässige Weitergabe der haploiden Genome benötigt. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse eine entwicklungsspezifische Plastizität des MEN: Das Signalnetzwerk wird nicht für das Durchlaufen der meiotischen Teilungen benötigt, verschiedene Komponenten wirken aber während bestimmter Schritte in der Sporenbildung und sichern so die erfolgreiche Weitergabe des Erbguts.