One ring to rule them all : Identification and characterization of the type IV pili secretin associated protein TsaP and analysis of the type IV secretion system of Neisseria gonorrhoeae

Im Laufe der Jahre hat Neisseria gonorrhoeae verschiedene Mechanismen entwickelt, um sich gegen eine Vielzahl von Antibiotika und Chemotherapeutika zu schützen. Die Hauptursache für diese rasche Ausbreitung von Resistenzen ist ein sehr effizienter horizontale Gentransfer. Die zu transferierende DNA wird dabei entweder mittels Konjugation direkt übertragen oder durch Autolyse der Gonokokken bzw. durch Sekretion von Einzelstrang DNA durch ein Typ-IV-Sekretionssystem (T4SS) an das extrazelluläre Milieu abgegeben. Die Aufnahme von DNA aus dem extrazellulären Milieu erfolgt in N. gonorhoeae durch Typ-IV-Pili (T4P) sowie das Kompetenz-System, welche DNA über die äußere und die innere Membran transportieren. Die funktionelle Charakterisierung des Typ-IV-Sekretions¬systems und des DNA-Aufnahme-Systems und somit der Typ-IV-Pili-Maschinerie könnte neue Anhaltspunkte für die Entwicklung therapeutischer Strategien liefern. Um das Transkriptionsnetzwerk des Typ-IV-Sekretionssystems in N. gonorrhoeae besser zu verste¬hen, wurden die für die DNA-Sekretion essentiellen Gene transkriptionell kartiert. Dieser Ansatz ergab, dass diese Gene in vier verschiedenen Operons enthalten sind. Die Analyse einer für die DNA-Sekretion nicht essentiellen Region, welche für das Einzelstrang-DNA bindende Protein SsbB sowie die Topoisomerase TopB kodiert, zeigte ferner, dass diese Gene signifikant höher exprimiert wurden als die an der DNA-Sekretion essentiell beteiligten Gene. Um zu untersuchen, ob die Einzelstrang-DNA, welche über das T4SS sekretiert wird, die Bildung von Biolfilm erleichtert, wurde die Fähigkeit verschiedener N. gonorrhoeae-Stämme zur Biofilm-Bildung mittels konfokaler Laser Scanning-Mikroskopie untersucht. Diese Analysen zeigten, dass die durch das T4SS sekretierte Einzelstrang-DNA eine Rolle in den frühen Stadien der Biofilmbildung spielt. In N. gonorrhoeae ist der in der äußeren Membran lokalisierte und durch PilQ gebildete Sekretin-Ring von einer zusätzlichen periphere Struktur umgeben. Diese besteht aus einem peripheren Ring und sieben davon ausgehenden Zacken. Um Proteine zu identifizieren, die für die Bildung der peripheren Struktur wichtig waren, wurden Proteine analysiert, die mit PilQ in der äußeren Membran lokalisiert sind. Durch dieses Vorgehen konnte ein Protein, das TsaP, kurz für Type-IV-Pilus-Sekretin-assoziiertes Protein, genannt wurde, als stark konservierte T4P-Komponente identifiziert werden. TsaP enthält ein N-terminales Kohlenhydrat bindendes Lysin-Motiv, auch als LysM-Domäne bekannt, und eine C-terminale Domäne mit unbekannter Funktion. In N. gonorrhoeae resultierte die Deletion von TsaP in der Bildung von Membranausstülpungen, die mit einer verminderten Bildung von oberflächenexponierten T4P einherging. Ferner konnte gezeigt werden, dass eine Deletion von TsaP keinen Einfluss auf den oligomerisations Zustand von PilQ hatte, jedoch zu einem Verlust der peripheren Struktur um PilQ führte. Weitere Analysen zeigten, dass TsaP an Peptidoglycan band und in Abhängigkeit von PilQ mit der äußeren Membran assoziierte. Darüber hinaus konnten neben der LysM-Domäne zwei FlgT-ähnliche Domänen und eine Linker-Region, die spezifisch für Neisseria spp. ist, ermittelt werden. Wir konnten zeigen, dass die Linker-Domäne in N. gonorrhoeae eine wichtige Rolle bei der Pilus-Biogenese spielte. Um festzustellen, ob TsaP direkt mit der B2-Domäne von PilQ interagierte, wurden TsaP und PilQ von N. gonorrhoeae und M. xanthus heterolog überexprimiert und gereinigt. Die Charakterisierung dieser Proteine zeigte, dass TsaP in der Lage war, SDS-stabile Komplexe zu bilden, welche eine ringförmige Struktur aufwiesen, und dass TsaP wahrscheinlich durch Interaktion mit PilQ eine Doppelringstruktur bildete. Wir vermuten, dass TsaP durch direkte Protein-Protein-Interaktion mit PilQ den Sekretin-Ring in der Peptidoglycan-Zellwand verankert und es dem Sekretin-Ring dadurch ermöglicht, den während der Pilus-Bildung und -Retraktion erzeugten Kräfte standzuhalten. Da T4P eine wichtige Rolle für die Pathogenität vieler Bakterien spielen und TsaP in Bakterien, die T4aP exprimieren, vorkommt und eine wichtige Funktion bei der T4aP-Biogenese hat, könnte TsaP einen neuen Angriffspunkt für zukünftige therapeutische Strategien darstellen.