Voltage sensitive phosphatases: understanding their function and expanding their potential use

Spannungsempfindliche Phosphatasen (englisch: Voltage Sensitive Phosphatases, VSPs) sind Proteine, die aus zwei unterschiedlichen Teilen bestehen: einer transmembranen Spannungssensor-Domäne (VSD) und einer zytosolischen Phosphatase-Domäne. Die Spannungssensor-Domäne steuert die katalytische Aktivität einer Phosphatase, sehr ähnlich wie bei dem menschlichen Tumorsuppressorprotein PTEN (Phosphatase- und Tensin-Homolog gelöscht von Chromosom 10). Die erste charakterisierte VSP, Ci-VSP, wurde vor einem Jahrzehnt, von der Seescheide Ciona Intestinalis isoliert. Ci-VSP hat bei Membrandepolarisation eine Phosphatase-Aktivität gegenüber Phosphoinositid (PI) Substraten und sie wirkt vor allem als 5-Phosphatase von PI(4,5)P2 und PI(3,4,5)P3. VSPs wurden in verschiedenen Spezies gefunden, einschließlich dem Menschen. Trotz des fehlenden vollständigen Verständnisses, sind VSPs ausgezeichnete Werkzeuge, um den Phosphoinositid-Gehalt der Plasmamembran in lebenden Zellen schnell und reversibel zu ändern. Der erste Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die weitere Charakterisierung und das Verständnis der Funktion der VSPs mit Hilfe gut etablierter Techniken. Wir verwendeten die Whole-Cell-Patch-Clamp-Technik, um die VSPs zu kontrollieren und Interne Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (englisch: Total Internal Reflection Fluorescence microscopy, TIRF) um ihre Aktivität aufzunehmen. Zuerst untersuchten wir die menschliche VSP-Isoform 1 (hVSP1). hVSP1 zeigt keine Plasmamembran-Lokalisation und deshalb ist es nicht tiefergehend charakterisiert worden. Hier haben wir versucht, hVSP1 an die Plasmamembran zu bringen und ihre enzymatische Aktivität zu untersuchen. Wir stellten fest, dass eine vollständige Ersetzung der Spannungssensor-Domäne von hVSP1 durch die von Ci-VSP eine membranständige, spannungsaktivierte 5-Phosphatase von PI(4,5)P2 ergibt. Angesichts der Ähnlichkeit der VSPs mit PTEN wurde durch Verbindung der VSD von Ci-VSP mit PTEN das chimärische Protein PTENCiV erstellt. PTENCiV, behält die vollständige enzymatische Aktivität von PTEN (PTEN wirkt als 3-Phosphatase von PI(3,4)P2 und PI(3,4,5)P3). Die zusätzliche Regulierbarkeit durch Spannung macht PTENCiV zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die Untersuchung dieses Tumorsuppressors. Insbesondere haben wir die enzymatische Aktivität der neuen Prostatakrebs-PTEN-Mutation A126G charakterisiert. Wir fanden heraus, dass die A126G-Mutante die Substratspezifität von PTEN von einer 3-zu einer 5-Phosphatase konvertiert. Es wird vermutet, dass VSPs in Prozessen, in denen pH- und Redox-Zustandsänderungen auftreten, beteiligt sind. Deshalb untersuchten wir als Nächstes die Wirkung von intrazellulärem pH-Wert und von Redox-Zustand auf VSPs. Wir sahen, dass ein saurer pH-Wert den PI(4,5)P2 Abbau in allen getesteten VSPs erhöht, und dass Oxidation die enzymatische Aktivität von Ci-VSP hemmt. Es scheint daher möglich, dass zusätzlich zur Spannung auch pH-Wert und Oxidation zu einer feinen Modulation von VSPs beitragen. Im zweiten Teil entwickelten wir eine leichtanwendbare Methode zur Manipulation von PI-Pegeln -unter Verwendung von VSPs aber ohne die Notwendigkeit der Patch-Clamp-Technik. Wir setzten verschiedene Kationenkanälen ein, die bei Aktivierung zu Membrandepolarisation führten und sequenziell zur VSP-Aktivierung. Als Nächstes charakterisierten wir Methoden um PI(4,5)P2 und PI(3,4,5)P3 unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie oder Photometrie zu kontrollieren. Außerdem haben wir die Anwendbarkeit dieser Techniken gezeigt, um die Wirkung von bekannten PTEN-Mutationen und PTEN-Inhibitoren durch Verwendung der PTENCiV Chimäre zu untersuchen. Als Ergebnis dieser Arbeit erhöhen wir das Verständnis über verschiedene Aspekte der VSP-Aktivität, einschließlich der Substrat Spezifität von hVSP1 und PTEN, sowie der Regulierung der VSP durch intrazellulären pH-Wert und Redox-Zustand. Außerdem haben wir einen Ansatz etabliert, der nicht nur zügige Manipulation und Kontrolle des PI-Gehalts in einer Population von Zellen zulässt, sondern der auch die Untersuchung von PTEN-Mutanten und Pharmakologie erleichtert.