Analysis of Bacillus subtilis spore germination and outgrowth in high-salinity environments

In Folge von Nährstoffverknappung kann das Bodenbakterium Bacillus subtilis resistente, metabolisch inaktive Sporen bilden. Diese Sporen bestehen aus einem dehydrierten Sporenkern der das Sporengenom enthält, umschlossen von einer inneren Sporenmembran, einer Keimzellwand und einem Cortex aus Peptidoglycan, einer äußeren Sporenmembran und einer mehrlagigen Protein-Schicht (‚Coat‘). Wenn bestimmte Nährstoffe (‚Keimungsinduktoren‘) verfügbar werden, können sie an Keimungsrezeptoren in der inneren Sporenmembran binden. Dies induziert die Spore-Reaktivierung, welche sich aus einer Keimungsphase und einer Auswachsphase (‚Outgrowth‘) zusammensetzt. Während der Keimung verlieren Sporen ihre Resistenzen, ersetzen die Ionen und das Ca2+-Dipicolinat (Ca2+-DPA) des Sporenkerns mit Wasser (Kern-Rehydrierung) und hydrolysieren ihren Cortex. Wenn der Wassergehalt des Kerns hoch genug für Enzymaktivitäten ist, wird der Metabolismus reaktiviert. Dies kennzeichnet den Beginn der Auswachsphase, während welcher sich die gekeimten Sporen molekular reorganisieren und ihr Elongationswachstum beginnt. Wie sich hohe Salzkonzentrationen und osmotischer Stress auf die Sporen-Reaktivierung auswirken war bisher kaum erforscht, obwohl dieses Themengebiet für Grundlagenforschung, Lebensmittelmikrobiologie, Bodenökologie und Astrobiologie relevant ist. Daher wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit die Auswirkungen von Salzstress auf die Bacillus Sporen-Reaktivierung mit Hauptaugenmerk auf die Keimung von B. subtilis in Gegenwart hoher NaCl Konzentrationen untersucht. Im Allgemeinen wirkten sich steigende Salzkonzentrationen zunehmend negativ auf die Keimung aus, obwohl ein Teil der Sporen trotz hoher Salinität die Keimung initiierte. In der Gegenwart von hohen NaCl Konzentrationen (≥ 1.2 mol/L) keimten B. subtilis Sporen verspätet, langsamer, heterogener und ineffizienter. Auch andere Salze inhibierten die Keimung, doch ihre inhibitorische Stärke variierte stark in Abhängigkeit von der jeweiligen Ionenkonzentration, der Art und Kombination der Ionen und den chemischen Eigenschaften des Salzes. Obwohl dies unterstreicht, dass ionischer Stress eine Rolle in der Inhibition spielt, hatten hohe Konzentrationen nicht-ionischer, osmotisch wirksamer Solute eine ähnlich inhibitorische Wirkung wie NaCl-Lösungen mit äquivalenter Osmolarität. Somit ist osmotischer Stress eine wesentliche Determinante der Keimungsinhibition durch NaCl. Interessanterweise keimten Sporen mit Coat-Defekten in der Gegenwart von NaCl noch wesentlich schlechter als intakte Sporen, nicht jedoch in der Gegenwart nicht-ionischer Solute. Dies legt nahe, dass der Coat (möglicherweise zusammen mit der äußeren Sporenmembran) eine wichtige Funktion zum Schutz der unterliegenden Sporenstrukturen (d.h. Cortex, Keimzellwand, Keimungsapparat und innere Sporenmembran) vor ionischem Stress besitzt. Basierend auf diesen Beobachtungen wurde im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit das erste mechanistische Modell zur Keimungsinhibition durch Salzstress erarbeitet. Laut diesem Modell erschweren ionische Interaktionen mit dem Keimungsinduktor und/oder dem Coat die Diffusion des Induktors zu den Rezeptoren in der inneren Sporenmembran, so dass die Keimung verspätet ausgelöst wird. Im Anschluss behindert osmotischer Stress die Kern-Rehydrierung und den damit verknüpften Ca2+-DPA Efflux, was den Gesamtprozess der Keimung verlangsamt. Obwohl eine metabolische Reaktivierung von Sporen selbst in der Gegenwart von 4.8 mol/L NaCl noch messbar war, konnte Outgrowth im Sinne von Elongation bis zu einer NaCl Konzentration von 2.4 mol/L in nährstoffreichem Medium beobachtet werden. Eine Transkriptom-Analyse Salz-gestresster, auswachsender Sporen zeigte viele Ähnlichkeiten zur Stress-Antwort kontinuierlich gestresster vegetativer Zellen. So wurde unter anderem das gesamte genetische Repertoire zur Synthese und Aufnahme kompatibler Solute induziert. Zusammenfassend konnte im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit das erste mechanistische Modell zur Keimungsinhibition durch Salzstress erarbeitet und die erste umfassende Transkriptom-Studie zur Salzstress-Antwort auswachsender Sporen durchgeführt werden. Diese Ergebnisse geben neue Einblicke in die Auswirkungen von Salzstress auf den Lebenszyklus von B. subtilis und könnten für die obengenannten Forschungsgebiete von angewandtem Nutzen sein.