Comprehensive analysis of peptidoglycan hydrolases in Caulobacter crescentus

The peptidoglycan (PG) sacculus is a large macromolecule enclosing most bacterial cells. During progression of the cell cycle, it needs to be continuously remodelled to enable elongation of the cell body and, finally, cell division. This process requires a delicate balance between synthetic and hydr...

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Main Author: Zielinska, Aleksandra
Contributors: Thanbichler, Martin (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2016
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Table of Contents: Der Peptidoglucan-Sacculus ist ein (einzelnes) großes Makromolekül, welches die meisten bakteriellen Zellen umhüllt. Während des Zellzyklus muss dieser kontinuierlich remodelliert werden, um den Elongationsprozess und letztlich auch die Zellteilung zu ermöglichen. Dieser Prozess benötigt ein empfindliches Gleichgewicht aus synthetischen und hydrolythischen Reaktionen, welche von einer Vielzahl an verschiedenen Enzymen durchgeführt werden. Jedoch sind die Aufgaben der einzelnen Komponenten dieser komplexen Maschinerie, noch deren zeitliche und räumliche Regulation bisher vollständig aufgeklärt. Insbesonders die Funktion und die Signifikanz der meisten PG-Hydrolasen ist noch weitgehend unbekannt. Während PG-Hydrolasen in allen Phasen der Zellwand-Biogenese beteiligt sind, besitzen sie eine besonders wichtige Rolle während der Zellteilung, bei der sie die streng regulierte Invagination der Zellwand, während des Abschnürprozesses, ermöglichen. Frühere Arbeiten identifizierten das PG-Hydrolase Homolog DipM als eine Schlüsselkomponente des Caulobacter crescentus Divisoms. Indes ist der Umfang, in dem Hydrolasen an der PG-Remodelierung bei dieser Spezies beitragen, noch unklar. Um die zentralen Faktoren zu identifizieren und ihre Funktion zu beleuchten, wurden in dieser Arbeit alle Amidasen, lytische Transglycosylasen (LTasen), Endopeptidasen (EPasen) und LD-Transpeptidasen (LD-TPasen) die im Genom von C. crescentus kodiert sind, analysiert. Dazu generierte ich eine Vielzahl an Fluoreszenzfusionen und Deletionsmutanten und analysierte diese mit mikroskopischen und biochemischen Methoden. Die daraus gewonnenen Erkenntnisse zeigten, dass die PG-Hydrolasen von C. crescentus hochgradig redundante Funktionen aufweisen. Basierend auf der Analyse der Zellmorphologien, Lokalisierungsdynamiken, Stress- und Antibiotika-Resistenz, konnte eine besonders wichtige Rolle der EPasen bei der Sicherstellung des korrekten Zellwachstums identifiziert werden. Die Deletion der amiC- und chap-Gene, welche Proteine mit Amidase-Aktivität kodieren, hatten keinerlei Effekt. Im Gegensatz dazu bildeten Mutanten mit multiplen Deletionen in EPase Genen, welche in die NlpC/P60- oder LytM-Familie fallen, lange glatte Filamente und gelegentlich Zellketten. Darüber hinaus ist die NlpC/P60 artige EPase NlpA zusammen mit Chap Amidasen redundant essentiell für das Zellwachstum. Eine Inaktivierung aller löslichen lytischen Transglycosylasen (SLTasen) führt zu einer Filamentierung zusammen mit der Bildung von Membranvesikeln. Depletion von DipM in Stämmen, in denen die SLTasen oder die verbleibenden LytM-Faktoren deletiert worden waren, führt zu einem kompletten Stillstand der Zellteilung und schließlich zum Zelltod. Interessanterweise wurde ein ähnlicher Phänotyp, auch bei Depletion von DipM in Zellen erhalten, denen die katalytisch inaktive EPase LdpF, fehlt. Eine Kultivierung unter Stress-Bedingungen zeigte eine eindeutige Funktion von LdpF, SdpA (einer SLTasen) und Chap bei der Zellhüllen-Biogenese, denn Deletionen in den entsprechenden Genen führten einerseits zu einer Osmo- oder Antibiotika-Sensitivität. Ferner zeigt SdpA ein dynamisches, Zellzyklus abhängiges Lokalisierungmuster, das dem von Divisom-assoziierten Proteinen entspricht, die an den finalen Schritten der Zellwandremodellierung beteiligt sind, was eine Funktion bei der Zellteilung unterstützt. Insgesamt stellt diese Arbeit die erste Umfassende Analyse von PG-Hydrolasen von C. crescentus dar und unterstreicht die Schlüsselfunktionder katalytisch inaktiven EPase-Homologe DipM und LdpF im autolytischen System in diesem Organismus.