Voltage-dependence of adrenoceptor activity : Mechanisms and signal transduction

G Protein-gekoppelte Rezeptoren bilden eine Superfamilie von Membranproteinen, die extrazelluläre Stimuli ins Zellinnere weiterleiten. Adrenozeptoren (AR) sind G Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), die der α-Untergruppe der Rhodopsin-Familie angehören. Die endogenen Katecholamine Noradrenalin und Adrenalin führen über die Aktivierung von Adrenozeptoren zur Regulation verschiedenster neuronaler, endokriner, kardiovaskulärer, vegetativer und metabolischer Funktionen. Zusätzlich zur klassischen Aktivierung von GPCRs durch Agonistenbindung an einen Rezeptor konnte die Regulation der Aktivität durch eine Veränderung des Membranpotentials für eine Reihe Gi- und Gq-gekoppelter Rezeptoren gezeigt werden. Zu Beginn dieser Arbeit war jedoch noch keine Untersuchung zur Spannungsabhängigkeit Gs-gekoppelter Rezeptoren beschrieben. Deshalb wurde in dieser Arbeit die Aktivität der Gs Protein-gekoppelten Adrenozeptoren β1-AR und β2-AR hinsichtlich ihrer Modulation durch das Membranpotential untersucht. Die Kombination Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-basierter Messungen und der patch-clamp Methode im voltage-clamp Modus ermöglichte die Aufzeichnung agonist- und spannungsabhängiger Änderungen von Proteinkonformationen oder von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Es wurden intramolekulare FRET-basierte Rezeptor-Fusionsproteine eingesetzt, um den Einfluss des Membranpotentials auf Bewegungen im aktivierten Rezeptormolekül direkt zu untersuchen. Für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen kamen intermolekulare FRET-Sensoren zum Einsatz. Mithilfe der Kombination aus FRET und elektrophysiologischen Messungen konnte in dieser Arbeit die Spannungsabhängigkeit des β1-AR gezeigt werden, die sich in einer Aktivitätsabnahme bei Depolarisation äußerte. Auch der eng verwandte β2-AR zeigte eine depolarisationsabhängige Abnahme der Aktivität, jedoch war diese schwächer ausgeprägt als bei β1-AR. Die Spannungsabhängigkeit übertrug sich für beide Rezeptoren auch auf die nachgeschaltete Signalkaskade. Diese Ergebnisse erweitern den Kreis spannungsabhängiger Rezeptoren um die Gruppe Gs-gekoppelter Rezeptoren. Im Falle des β1-AR wurde die Spannungsabhängigkeit hauptsächlich über eine Änderung der intrinsischen Aktivität der Agonisten Isoprenalin und Adrenalin vermittelt. Dies ist erstaunlich, da bisher die Spannungsabhängigkeit von Rezeptoren, die durch endogene Agonisten aktiviert wurden, nur eine Regulation der Agonistaffinität bekannt war. Es konnte ebenfalls eine agonistspezifische Komponente der β1-AR Spannungsabhängigkeit ermittelt werden: Mit Dopamin aktivierte Rezeptoren zeigten eine Zunahme ihrer Aktivität während der Depolarisation während die Isoprenalin-, Noradrenalin-, Adrenalin- und Dobutamin-vermittelte Aktivität bei positiven Membranpotentialen abnahm. Der entgegengesetzten Spannungsabhängigkeit von Dopamin-aktivierten Rezeptoren könnte ein geändertes Bindungsverhalten von Dopamin in der Rezeptorbindetasche zugrunde liegen. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung des molekularen Mechanismus, der der Spannungsabhängigkeit zugrunde liegt. Hierfür wurden verschiedene Aminosäuren im spannungsabhängigen α2A-AR mutiert. Die Neutralisation einer geladenen Aminosäure und der Änderung einer Aminosäure, die an der Agonistbindung beteiligt ist, schienen die Spannungsabhängigkeit nicht zu beeinflussen. Jedoch führte das Einbringen einer zusätzlichen, positiven Ladung in die Nähe des hochkonservierten Aspartats D2.50 in TM2 zu einer Reduktion der Spannungsabhängigkeit. Diese Aminosäure könnte eine Komponente des Spannungssensors des α2A-AR sein, jedoch sind weitere Experimente nötig, um diese Hypothese zu untermauern. Zusammengefasst erweitern die in dieser Arbeit vorgestellten Daten die Gruppe der spannungsabhängigen GPCR um jene, die ihr Signal über stimulatorische Gs-Proteine vermitteln. Besonders in erregbaren Geweben wie dem Herzen, das β1-AR exprimiert, könnte das Membranpotential für eine zusätzliche Feinregulation der Rezeptoraktivität sorgen. Dies könnte sich im zeitlichen Rahmen kardialer Aktionspotentiale abspielen und ohne die Dissoziation des Agonisten vor sich gehen. Auf molekularer Ebene ist eine Beteiligung des hochkonservierten Aspartats in TM2 (D2.50) an der Erkennung von Spannungsänderungen der Plasmamembran im α2A-AR denkbar. Ob sich dies auch auf andere spannungsabhängige GPCRs übertragen lässt, bleibt zu ermitteln.