Bio-synthesised LytC protein kills bacteria and the study of protein dynamics in B. subtilis

Eine Vielzahl von Antibiotika greifen in die Zellwandsynthese ein. Gegen fast alle gängigen Antibiotika existieren Resistenzen, die von einem Bakterium in das andere weitergegeben werden können. Daher wollten wir eine alternative Strategie verfolgen und Zellwand-degradierende Enzyme einsetzten, um Bakterien durch externe Zugabe zu lysieren. LytC iste in sogenanntes Autolysin von Bacillus subtilis, das in der Lage ist, Brüche in die Zellwand einzuführen, und ist ein Kandidat für unsere Strategie. Ich habe das lytC Gen kloniert und das Protein in E. coli Zellen überproduziert, und anschließend aufgereinigt. Um die Funktion der verschiedenen LytC Domänen zu untersuchen, haben wir unterschiedliche Konstrukte von LytC hergestellt. LytC besitzt eine “low complexity region” (LCR), vier Zellwand-Bindedomänen (CWB) und eine funktionale Hydrolase Domäne. Ich habe das Gram negative Bakterium E. coli und den Gram positiven Organismus B. subtilis verwendet, um zu untersuchen, ob extern zugegebenes LytC zur Zelllyse führen kann. Die Ergebnisse zeigten dass LytC effizient das Wachstum beider Organismen hemmen kann, wobei dieser Effekt nur in der exponentiellen Wachstumsphase zu beobachten war. Eine C-terminale Fusion von LytC mit einem Strepavidin-tag konnte effizient überproduziert und gereinigt werden, ein N-terminaler nicht. Die Überexpression von LytC führte zu einem schnellen Absinken der optischen Dichte, eine Stunde nach Induktion der Transkription. Das LytCF6 Konstrukt bestand nur aus der Hydrolase Domäne und konnte Zelllyse herbeiführen, was zeigt, dass die CWD und die LCR Domänen nicht essentiell für die Aktivität sind. Kontrollversuche mit BSA oder Elutionspuffer belegten, dass die Aktivität spezifisch für LytC ist. Eine Deletion von 22 Aminosäuren von C-Terminus der funktionalen Domäne führten zu einer starken Reduktion der lytischen Aktivität, was zusätzlich belegt, dass die wachstumshemmende Aktivität von LytCF2 stammt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Lokalisation und die Einzelmolekülbewegungen von Proteinen MreB, MreC, MreD, Pbp1A und RodZ, die an der Zellmorphologie in vielen Bakterien beteiligt sind, und den Untereinheiten der Pyruvat-Dehydrogenase (PDH) und der Phosphofruktokinase (PfkA) als zytosolische Proteine untersucht. Die Morphologie-Proteine sind entweder Membran-integral, oder Membran-assoziiert, was die Lokalisation der fluoreszierenden Fusionsproteine bestätigte. MreB aus B. subtilis und aus E. coli bildete, wie zuvor beschrieben, filamentöse Strukturen an der Zellmembran aus. Eine Reduktion des Expressionsniveaus von MreB führte zur Ausbildung kurzer Filamente und diffuser Aggregate. MreC und MreD interagieren mit MreB und lokalisierten in punktuellen Mutsren innerhalb der Membran. Die PDH Untereinheiten PdhB, PdhC und die PfkA wiesen homogene Lokalisation in der Zelle auf, im Einklang mit einer zytosolischen Enzym-Funktion. Interessanterweise lokalisierte PdhA an nur einem Zellpol in zwei Dritteln der Zellen, und PdhD wies zwei Lokalisationsmuster auf, ein homogen zytosolisches, und eines, dass mit der Lokalisation der Chromosomen im Nukleoid überein stimmte. Dem entsprechend haben zwei der vier Untereinheiten der PDH eine spezifische Lokalisation in B. subtilis Zellen. Durch Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie und automatisierter Molekülverfolgung konnte bestimmt werden, dass MreB Moleküle zwei Populationen ausbilden, eine eher immobile Population, die in den filamentösen Strukturen vorhanden ist, und eine bewegliche aus diffundierenden Molekülen. Die Mehrheit der MreB Moleküle ist immobil und damit in filamentöser Struktur. Auch MreC, MreD und RodZ, sowie Pbp1A und die PDH Untereinheiten wiesen eine statische und eine dynamische Population auf, nur PfkA zeigte zwei dynamische Populationen, die vermutlich aus einer Population langsamer und schnell diffundierender Proteine besteht. Die Diffusionsgeschwindigkeit der der dynamischen MreB Moleküle ist deutlich niedriger als die der PfkA Moleküle, was vermuten lässt, dass MreB hauptsächlich entlang der Membran diffundiert, was die Diffusion verringert. Die E2 Untereinheit der PDH, PdhC, scheint die zentrale Untereinheit der PDH zu sein, da sie die geringste Diffusionskonstante der vier Untereinheiten aufwies, und daher die meisten PdhC Moleküle im Komplex gebunden sind, während die übrigen in höherem Masse zwischen freier und gebundener Form wechseln.