Structural Characterization of the Heterobactin Siderophores from Rhodococcuserythropolis PR4 and Elucidation of their Biosynthetic Machinery

Zusammenfassung Der Genus Rhodococcus gehört zu der Ordnung der Actinomycetales. Diese sind gram-positive Bakterien mit einem hohen GC-Gehalt, welche eine große Anzahl an Sekundärmetaboliten produzieren, die in der pharmazeutischen Industrie und in der Biotechnologie Anwendung gefunden haben. Die meisten dieser bioaktiven Verbindungen stammen entweder von nicht-ribosomalen Peptiden (NRP) oder Polyketiden (PK), von denen bisher jedoch nur wenige isoliert wurden. Nichtsdestotrotz wurde insbesondere innerhalb des Rhodococcus-Genus eine bemerkenswerte strukturelle Vielfalt von Siderophoren durch die Strukturaufklärung von Rhodochelin, Rhodobactin und Heterobactin A1 nachgewiesen. Deshalb wurde der Fokus dieser Arbeit auf die Isolierung und Charakterisierung von neuen Siderophor-Strukturen gelegt, um das chemische Potential in diesem Genus noch stärker hervorzuheben. In der vorliegenden Arbeit wird über die Isolierung, strukturelle Charakterisierung und Aufklärung des Biosyntheseursprungs des Siderophors Heterobactin berichtet. Dieser ist ein Catecholat-Hydroxamat-Mischtyp aus Rhodococcus erythropolis. Die Strukturaufklärung des extrahierten und gereinigten Siderophors Heterobactin A wurde mittels MSn-Analytik und NMR- Spektroskopie durchgeführt und zeigte die Anwesenheit einer besonderen Peptidbindung zwischen der Guanidingruppe eines Argininrestes und einer 2,3-Dihydroxybenzoatgruppe. Die beiden isolierten Heterobactin-Varianten S1 und S2 sind zudem Derivate von Heterobactin A, die eine Sulfonierung an den Aromaten aufweisen. Die bioinformatische Untersuchung des R. erythropolis PR4 Genoms und die anschließende biochemische Charakterisierung der putativen Biosynthesemaschinerie halfen das Gencluster zu identifizieren, das für die Biosynthese der Heterobactine verantwortlich ist. Interessanterweise verfügt die HtbG NRPS-Synthetase, die aus drei Modulen besteht, innerhalb ihres zweiten Moduls über eine nie zuvor beobachtete C-PCP-A Domänenorganisation, welche notwendig sein könnte für die korrekte Verlängerung der Peptidintermediate. Die vorliegende Arbeit korrigiert zudem die von Carrano et al. in 2001 beschriebene Heterobactin A Struktur. Die biochemische Charakterisierung der Monooxygenase HMO (kodiert vom Gen hmo) etablierte zudem die Biosyntheseroute der nicht-proteinogenen Aminosäure L-hOrn, bevor diese durch die NRPS-Maschinerie in das Peptidgerüst (Siderophor) eingefügt wird. Die Ergebnisse aus der strukturellen und biochemischen Charakterisierung der Heterobactine erlauben, zusammen mit der genetischen und biochemischen Charakterisierung der jeweiligen Biosynthesegencluster, den Vorschlag eines Biosynthesemodells für die Heterobactin-Assemblierung, In dieser arbeit wurde auch das Siderophor-Bindungsprotein htbH biochemisch untersucht, wobei seine hohe Affinität zum Mischtyp Catecholat-Hydroxamat Siderophor gezeigt werden konnte.