Characterization of a minimal Type I CRISPR-Cas system found in Shewanella putrefaciens CN-32

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas (CRISPR-assoziiert) ist ein adaptives Immunsystem in Prokaryoten, das fremde DNA oder RNA mit Hilfe von kleinen CRISPR-RNAs (crRNAs) erkennt und diese anschließend degradiert. Das CRISPR-Cas System besteht dabei aus einem CRISPR-Lokus und einer Gruppe von cas Genen. Individuelle crRNA Moleküle werden aus einem langen Transkript des CRISPR-Lokus generiert und im Anschluss in CRISPR-Ribonukleoproteinkomplexen inkorporiert. Diese bestehen aus verschiedenen Cas-Proteinuntereinheiten bestehen und übernehmen die Funktion der zellulären Kontrolle der Immunantwort. Die Typ I CRISPR-Cas Systeme sind gekennzeichnet durch die Anwesenheit des Signatur-Proteins Cas3 und des CRISPR- Ribonukleoproteinkomplexes mit der Bezeichnung Cascade. Dabei variieren die Cas-Proteine in den jeweiligen Cascade-Komplexen der unterschiedlichen Subtypen von Typ I CRISPR-Cas Systemen. Eine minimale Variante eines Typ I-F Systems konnte in Shewanella putrefaciens CN-32 identifiziert werden. Das Genom von S. putrefaciens CN-32 enthält dabei nur fünf Cas Proteine (Cas1, Cas3, Cas6f, Cas1821 und Cas1822) und einen einzelnen CRISPR-Lokus mit 81 Spacer-Sequenzen. Dieses System beinhaltet Cas1, eine Integrase welche die Integration neuer Spacer vermittelt, Cas3, eine Nuklease welche die Ziel-DNA degradiert und Cas6f, eine Endonuklease die reife crRNAs generiert. Die zwei weiteren Proteine, Cas1821 und Cas1822, zeigen keine Sequenzähnlichkeit zu allen bisher bekannten Cas-Protein Familien. Die große Untereinheit des Cascade-Komplexes, die in anderen Subtypen verantwortlich für die Identifizierung der Ziel-DNA ist, fehlt. RNA-Seq Analysen wiesen die Transkription des CRISPR-Lokus und die Herstellung der reifen crRNAs nach. Interferenz-Aktivität für dieses minimale System konnte in vivo mit Hilfe eines Plasmid Konjugations-Assays gezeigt werden. Die Interferenz-Aktivität war dabei abhängig von der Erkennung des Dinukleotids „GG“ in unmittelbarer Nähe zur Ziel-Sequenz. Dieses Motiv wird PAM (Protospacer Adjacent Motif) genannt. Die Deletion von cas1821 und cas1822 in S. putrefaciens CN-32 führte zur Aufhebung der in vivo Interferenz Aktivität und resultierte gleichzeitig in dem Verlust einer stabilen crRNA-Population in der Zelle. Ein minimaler Cascade Komplex konnte isoliert werden, der aus Cas1822, Cas6f, mehreren Kopien von Cas1821 und reifer crRNA besteht. Rekombinant hergestelltes Cas1821 bildete durch Bindung von RNA lange helikale Filamente aus und die Analyse von Stämmen mit Cas1822 Mutationen demonstrierte die Abhängigkeit der DNA Interferenz-Aktivität von konservierten Arginin-Resten in Cas1822. Es wird diskutiert, ob Cas1822 oder Cas3, welches einen konservierten Cas2-ähnlichen Bereich am N-terminalen Ende enthält, die Funktion der kleinen und großen Untereinheiten ersetzen zu können. Diese Ergebnisse geben Einblicke in die Evolution von reduzierten CRISPR-Cas Systemen und demonstrieren Cascade-Funktionalität ohne die Anwesenheit einer großen und kleinen Untereinheit.