Examining Uptake of Nanomaterials by Eukaryotic Cells with Digital Image Cytometry

Künstliche Nanomaterialien eignen sich aufgrund ihrer winzigen Größe und der damit verbundenen interessanten Eigenschaften für zahlreiche biologische und medizinische Anwendungen. Die Wechselwirkungen auf zellulärer Ebene hängen von einer Vielzahl unterschiedlicher Faktoren ab. Um die Wirksamkeit und Toxizität von Nanopartikeln einschätzen zu können, ist es notwendig, ihre zelluläre Aufnahme, ihren intrazellulären Transport und letztendlichen intrazel-lulären Verbleib sowie die durch sie ausgelöste Zellantwort zu verstehen. Die genannten Faktoren werden ihrerseits von den physikalisch-chemischen Parame-tern des eingesetzten Nanomaterials wie z.B. Größe, Oberflächenchemie, Ober-flächenladung und Elastizität beeinflusst. Durch Fluoreszenzmikroskopie lassen sich mit einer Vielzahl kommerziell er-hältlicher, fluoreszierender Reporterfarbstoffe viele zelluläre Funktionen abbilden und auswerten. Zur bildbasierten Quantifizierung von Zellmerkmalen (engl. Image Cytometry) eignen sich Computer-basierte Algorithmen sehr gut, da Ver-fälschungen durch die subjektive Wahrnehmung und Beobachtungsperspektive des Experimentators vermieden werden können. Diese im folgenden als Digital Image Cytometry bezeichnete Methode profitiert von automatisierter Mikroskopie, da eine große Anzahl von Zellen abgebildet werden muss, um in der Lage zu sein, einzelne Populationen zu identifizieren und statistisch aussagekräftige Resultate zu erzielen. Diese Methode wurde in der vorliegenden Arbeit zur Untersuchung der Auswirkung von plasmonischen Gold-Nanopartikeln (Au NP) auf die Morpholo-gie und die Lebensfähigkeit von menschlichen Endothel- und Epithelzellen (HUVEC- und HeLa-Zellen) angewandt. Die verwendeten 4 5 nm großen Au NP sind mit Polymethacrylsäure umhüllt und ihre physikalisch-chemischen Eigen-schaften sind nahezu vollständig beschrieben. Mehr oder weniger identische Gold-Nanopartikel sind bereits in mehreren zuvor durchgeführten und entsprechend dokumentierten Studien eingesetzt worden und bieten interessante An-wendungsmöglichkeiten im biomedizinischen Bereich. Die verwendeten Gold-Nanopartikel werden nach der Aufnahme in intrazellulären lysosomalen Struk-turen angereichert. Als Ergebnis des ersten Teils der Arbeit lässt sich eine signi-fikante Auswirkung der eingesetzten Nanopartikel auf die Morphologie von Mi-tochondrien und Lysosomen sowie auf die Struktur des Aktinzytoskeletts und insbesondere auf die Teilungsfähigkeit der Zellen (Proliferationsfähigkeit) be-obachten. Bemerkenswert ist die Tatsache, dass die dafür ausreichende Dosis um ein bis zwei Größenordnungen geringer ist als diejenige, bei der akute Zyto-toxizität und erhöhte Werte von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) gemessen werden. Der zweite Teil dieser Arbeit beruht auf Untersuchungen des Endozytose-Vorgangs von Polymer-Mikrokapseln. Diese stellen ein interessantes Trägersystem dar, um Wirkstoffe in das Zellinnere zu transportieren und dort freizusetzen. Nach der Aufnahme durch Lipid Raft-vermittelte Phagozytose durchlaufen die Kapseln eine intrazelluläre Kaskade von immer azidischer werdenden Vesikeln. Durch das Einbringen eines pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffs in die Kapseln kann ihr Aufnahmevorgang mittels der damit assoziierten Ansäuerung zeitaufgelöst abgebildet werden. Die Kinetik des Ansäuerungs-prozesses hängt dabei maßgeblich von der Elastizität der Kapseln ab. Weiche Partikel mit hoher Elastizität werden schneller in Lysosomen transportiert als weniger elastische. Außerdem wird mit diesem Sensorpartikelsystem die Relevanz der V1G1-Untereinheit der an der Ansäuerung lysosomaler Vesikel beteiligten vakuolären ATPase verifiziert.