Synthesis, Identification, Kinetic, and Structural Characterization of Inhibitors of the Aspartic Proteases HTLV-1 Protease and Endothiapepsin

Diese Arbeit umfasst die Identifizierung und Synthese sowie enzymkinetische und strukturelle Charakterisierung von nicht-peptidischen Kleinmolekülen als Inhibitoren der beiden Aspartylproteasen HTLV-1-Protease und Endothiapepsin. Die HTLV-1-Protease stellt ein vielversprechendes Zielenzym für die Behandlung von viralen Infektionen mit dem Humanen T-Zell-Leukämie-Virus (HTLV) dar und ist eng verwandt mit der bekannteren HIV-1-Protease. Trotz struktureller Ähnlichkeit beider Proteasen unterscheiden sich diese jedoch deutlich voneinander hinsichtlich ihrer Substrat- und Inhibitorspezifität. Jedoch stellen auf Grund der Ähnlichkeiten im aktiven Zentrum einige der bereits bekannten HIV-1-Protease-Inhibitoren einen geeigneten und vielversprechenden Startpunkt für die Identifizierung und Optimierung von neuartigen Kleinmolekülen zur Inhibition der HTLV-1-Protease dar, über deren Bindungsmodus vor Aufnahme dieser Arbeiten allerdings noch nichts bekannt war. Nach erfolgreicher in-house-Etablierung der Expression, der Proteinreinigung, eines Affinitätsassays sowie geeigneter Kristallisationsbedingungen für die HTLV-1-Protease wurde zunächst der bekannte HIV-1-Protease-Inhibitor Indinavir, der gegenüber der HTLV-1-PR eine Affinität im einstellig mikromolaren Bereich aufweist, näher untersucht. Die Affinität (Ki: 3,5 µM) gegenüber der HTLV-1-Protease ist im Vergleich zur HIV-1-Protease (540 pM) zwar deutlich geringer, jedoch weisen andere hoch-affine HIV-1 PR-Inhibitoren (Saquinavir, Ritonavir, Nelfinavir und Amprenavir) keine nennenswerte Affinität gegenüber der HTLV-1-Protease auf (Ki > 20 µM). Im Rahmen dieser Arbeit konnte mit der Kristallstruktur von Indinavir im Komplex mit der HTLV-1-Protease die nach unserem Wissen erste HTLV-1-Protease-Kristallstruktur mit einem nicht-peptidischen Inhibitor beschrieben werden. Die so erhaltenen strukturellen Informationen tragen maßgeblich zum Verständnis der moderaten Affinität von Indinavir gegenüber der HTLV-1-Protease bei und legten darüber hinaus den Grundstein für weitere strukturbasierte Optimierungsansätze. In einem zweiten Ansatz zur Leitstrukturidentifizierung wurde das Konzept der „privilegierten Strukturen“ zur Identifizierung neuartiger niedermolekularer Grundgerüste für die HTLV-1 PR-Inhibition verfolgt. Durch Screening der Arbeitskreis-internen Substanzbibliothek verschiedener Aspartylproteaseinhibitoren konnten C2-symmetrische 3,4-bis-N-alkylsulfonamid-substituierte Pyrrolidine sowie bizyklische Pyrrolidine als vielversprechende Kandidaten zur Inhibition der HTLV-1-Protease identifiziert werden. Beide Inhibitorklassen wurden ursprünglich als HIV-1-Protease-Inhibitoren entwickelt und im Rahmen dieser Arbeit bezüglich ihrer enzymkinetischen und strukturellen Eigenschaften gegenüber der HTLV-1-Protease genauer untersucht. Aus einer Serie mit zehn C2-symmetrischen 3,4-bis-N-alkylsulfonamid-substituierten Pyrrolidinen stellt die Verbindung AB84 mit einer Affinität von 15 nM nicht nur den affinsten Vertreter dieser Serie, sondern, nach bestem Wissen, auch den bislang affinsten nicht-peptidischen HTLV-1-Protease-Inhibitor dar. Die erfolgreiche Bestimmung der Kristallstrukturen von AB84 sowie einem weiteren Vertreter dieser Inhibitorklasse, ermöglichte ebenfalls die strukturbasierte Interpretation der Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR). Die bizyklischen Pyrrolidin-basierten Inhibitoren weisen Affinitäten im drei- bis einstellig micromolaren Bereich auf, wobei eine mit zwei Benzhydrylgruppen substituierte Verbindung den bisher aktivsten Vertreter dieser Inhibitorserie (Ki: 1,4 µM) darstellt. Eine Kristallstruktur dieser Verbindungsklasse wurde mit NK101 erfolgreich bestimmt. Basierend auf den erhaltenen, grundlegenden Erkenntnissen über den Bindungsmodus sowie der abgeleiteten SAR bieten beide Grundgerüste vielversprechende Optionen für die weitere strukturbasierte Leitstrukturoptimierung. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Aspartylprotease Endothiapepsin, einem bekannten Modellenzym für Aspartylproteasen. Verschiedene Verbindungen mit einem 2-Amino-Thiophen Grundgerüst wurden basierend auf der Gewald-Reaktion synthetisiert. Überraschenderweise wurden innerhalb einer Serie von acht strukturell sehr ähnlichen Liganden vier verschiedene Bindungsmodi gefunden, was im Nachhinein erklärt, warum die auf den Affinitätsdaten und der Kristallstruktur der Leitstruktur basierte SAR nicht schlüssig interpretiert werden konnte. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Unstimmigkeiten bei der Korrelation von klassischen Affinitäts- mit TSA-Daten einen Hinweis auf eine geänderte Bindungsgeometrie liefern können. Die hier präsentierte Fallstudie unterstreicht eindrucksvoll die Komplexität des Bindungsgeschehens von Liganden, dessen Abhängigkeit von kleinsten chemischen Veränderungen am Substitutionsmuster einer Leitstruktur und die Notwendigkeit der kontinuierlichen Überwachung der Bindungsmodi während einer Leitstrukturoptimierung.