Inhibitors of p53 and HIF-prolyl-4-hydroxylases provide mitochondrial protection in a model of oxytosis

Eine der wichtigsten Aufgaben von Mitochondrien ist die Bereitstellung von Energie in Form von ATP. Daher werden sie oft auch als Kraftwerke der Zelle bezeichnet. Darüber hinaus erfüllen Mitochondrien zentrale Funktionen im Zellstoffwechsel. Da neuronale Zellen einen sehr hohen Energiebedarf aufweisen, sind sie in besonderem Maße auf die physiologischen Funktionen der Mitochondrien angewiesen. Mitochondrien spielen eine Schlüsselrolle in der neuronalen Apoptose. Deshalb wird der Schutz von Mitochondrien zunehmend als eine Strategie zur wirkungsvollen Bekämpfung und Behandlung dieser Erkrankungen verfolgt. Zwei Proteine, die möglicherweise in der Entstehung und Progression neurodegenerativer Erkrankungen eine Rolle spielen, sind p53 und die Isoform 1 der HIF-prolyl-4-hydroxylasen (PHD). Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, die Funktion dieser beiden Proteine im neuronalen Zelltod näher zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde die murine, hippocampale Zelllinie HT-22 verwendet, die ein etabliertes Modellsystem zur Erforschung des Caspase-unabhängigen intrinsischen Zelltods darstellt, der in diesem Modell durch die extrazelluläre Zugabe von Glutamat hervorgerufen wird. Diese Art des Zelltods wird auch als Oxytose bezeichnet. Des Weiteren wurde die Substanz Erastin eingesetzt, um den Tod der HT-22 Zellen nach dem Muster der Ferroptose herbeizuführen. Im ersten Teil der Arbeit wurden die Effekte einer verminderten Expression von p53, die durch den Einsatz einer p53 siRNA erreicht wurde, auf den neuronalen Zelltod untersucht. Eine Reduktion der p53-Spiegel konnte den durch Glutamat provozierten Tod der HT-22 Zellen um circa zwei Stunden verzögern. Dagegen war die Reduktion der p53 Proteinmenge nicht in der Lage, die Schädigung der Mitochondrien zu verhindern. Diese zeigte sich in einem erhöhten Fragmentierungsgrad der Mitochondrien und einer Depolarisation der mitochondrialen Membran. Die Beeinträchtigung der Mitochondrienfunktion wurde jedoch nicht durch einen direkten Einfluss von p53 auf die Mitochondrien ausgelöst, da weder für p53 noch für phosphoryliertes p53 eine Translokation zu den Mitochondrien nach Glutamatbehandlung gezeigt werden konnte. Die Durchführung eines Reporter-Assays offenbarte weiterhin eine Reduktion der transkriptionellen Aktivität von p53 in Zellen, die zuvor mit p53 siRNA behandelt worden waren. Im Gegensatz dazu zeigte der p53-Inhibitor PFTα eine ausgeprägte Protektion der HT-22 Zellen gegenüber Glutamat und war auch in der Lage, die Struktur und Funktion der Mitochondrien zu erhalten, was sich in einem tubulären Erscheinungsbild der Mitochondrien, einer verminderten Produktion von ROS, einem intakten Membranpotenzial und physiologischen ATP-Spiegeln zeigte. Außerdem verhinderte PFTα den Tod der HT-22 Zellen, wenn es bis zu vier Stunden nach dem Beginn der Glutamatbehandlung appliziert wurde. Darüber hinaus war PFTα sogar im Stande, HT-22 Zellen mit reduzierten p53-Spiegeln vor der Glutamatschädigung zu schützen. Diese Ergebnisse bestätigen das große neuroprotektive Potenzial von PFTα und deuten darauf hin, dass der Effekt von PFTα vor oder zum Zeitpunkt der Mitochondrienschädigung zum Tragen kommt. Weiterhin scheinen andere durch PFTα hervorgerufene Effekte unabhängig von der p53-Blockade zum Schutz der Neurone beizutragen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss von PHDs auf den neuronalen Zelltod untersucht. Dafür wurden die verschiedenen PHD-Inhibitoren DFO, DHB, CPO und Oxyquinoline sowie zwei siRNA Sequenzen zur Verminderung der Expression von PHD1 verwendet. Sowohl die pharmakologischen Inhibitoren als auch die gentechnische Reduktion der PHD1-Spiegel schützten die HT-22 Zellen vor dem Zelltod durch Glutamatschädigung sowie der daraus folgenden Lipidperoxidation und Schädigung der Mitochondrien. Die Funktionalität der Mitochondrien wurde durch Untersuchungen der mitochondrialen Atmung sowie des Membranpotenzials und der ATP-Spiegel nachgewiesen. Außerdem führten beide Ansätze zur Hemmung der PHDs zu einer verminderten Produktion von ROS in den Mitochondrien und verhinderten die durch oxidativen Stress hervorgerufene Fragmentierung der Mitochondrien. Auch wenn die Effekte der PHD1 siRNA signifikant geringer waren als die der pharmakologischen Inhibitoren, deuten diese Ergebnisse insgesamt darauf hin, dass sowohl die selektive Hemmung der PHD1 Expression als auch die pharmakologische Inhibition aller PHD Isoformen zu einem Schutz der Mitochondrien und damit zur Neuroprotektion beitragen. In einem letzten Schritt wurde gezeigt, dass sowohl die pharmakologischen PHD-Inhibitoren als auch die verminderte Expression von PHD1 zu einer Protektion der HT-22 Zellen im Model der Ferroptose führen, was die Bedeutung der PHDs für den neuronalen Zelltod unterstreicht und sie als vielversprechende Zielstruktur in der Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen hervorhebt.