Polymerase mutations promoting adaptation of avian influenza virus of subtype H9N2 to mammals

Influenza-A-Viren kommen in großer Vielzahl bei Vögeln vor. Wenn Viren aus diesem Reservoir auf den Menschen übertragen werden und sich an den neuen Wirt anpassen, kann es zu einer Pandemie kommen. Unter den aviären Viren verdienen hierbei Viren vom Subtyp H9N2 besondere Aufmerksamkeit. Diese Viren zeichnen sich durch weltweite Verbreitung, außergewöhnliche genetische Flexibilität, die Fähigkeit zu menschlicher Infektion und somit durch ein erhebliches pandemisches Potential aus. Bei ihrer Vermehrung gehen die Viren vielfältige Wechselwirkungen mit dem Wirt ein. Der Wirtswechsel vom Vogel auf den Menschen beruht deswegen wesentlich auf der Adaption der Virusproteine an menschliche Gewebe und Zellen. Eine wichtige Rolle spielt dabei das zum viralen Polymerasekomplex gehörende PB2-Protein. In der vorliegenden Arbeit wurde die funktionelle Bedeutung von 6 adaptiven Mutationen im PB2-Protein von H9N2 Viren untersucht. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Mutationen D253N, E627K, D701N, S714I und S714R in der PB2-Untereinheit die Polymeraseaktivität von H9N2-Viren in Säugerzellen erhöhen. Darüber hinaus führten die Mutationen E627K, D701N und S714I/R zu einem erhöhten Viruswachstum in Säugerzellen. Pathogenitätsstudien zeigten, dass die Kombination der Mutationen E627K-D701N-S714R die Letalität von H9N2-Viren in Mäusen erhöht. Um die Relevanz der adaptiven Mutationen, die im H9N2 Hintergrund beobachtet wurden, zu validieren, wurde der Einfluss dieser Mutationen in H9N2-, H7N9-, H1N1pdm09- und H7N7-Viren verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass die adaptiven Mutationen die Polymeraseaktivität in den phylogenetisch verwandten H9N2- und H7N9-Viren deutlich stärker erhöhten als in den nicht verwandten H7N7- und H1N1pdm09-Viren. Die Analyse von heterologen Polymerasekomplexen aus H9N2, H1N1pdm09, H7N7 und H7N9 Untereinheiten zeigte, dass die starke Aktivitätssteigerung der H9N2-Polymerase nur von den adaptiven PB2-Mutationen, jedoch nicht von PB1 und PA abhängt. Aus dieser Beobachtung kann geschlossen werden, dass sich die Polymerase der H9N2-Viren durch eine besonders hohe Anpassungsfähigkeit an Säugerzellen auszeichnet Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Mechanismen untersucht, aufgrund derer die E627K und D701N Mutationen die Adaptation an Säuger fördern. Es konnte gezeigt werden, dass die Nukleokapside aviärer Viren mit der PB2-Signatur 627E nach der Infektion einer Säugerzelle im Zytoplasma durch die Binding von RIG-I destabilisiert werden, so dass es zur Exposition der ds-RNA Domänen der viralen RNA kommt. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die freiliegende ds-RNA nun in der Lage ist, die zytoplasmatische RNA-Helikase RIG-I zu binden und damit deren antivirale Eigenschaften zu aktivieren. Die Stabilität der Nukleokapside bleibt dagegen erhalten, wenn PB2 die Signatur 627K trägt, so dass die RIG-I-abhängige Hemmung der Virusvermehrung nun ausbleibt. Somit konnte nachgewiesen werden, dass die adaptive Mutation E627K die Hemmung der Virusvermehrung durch den Pathogensensor RIG-I moduliert. Darüber hinaus zeigten die Daten, dass die PB2-Mutation D701N nicht nur den nukleären Import von neu synthetisierten PB2-Proteinen steigert, sondern auch den Kernimport von Nukleokapsiden infizierender Viren.