Endozytose des Kaliumkanals Kir2.1

Der exakte Mechanismus, welcher die Regulation der Oberfächenexpression des Kaliumkanals Kir2.1 beschreibt, ist bisher nicht abschließend aufgeklärt. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, wie die Kir2.1-Oberflächenexpression gesteuert wird, indem der Kanal durch den Clathrin-abhängigen Endozytoseweg der Zelle geschleust wird und welche Signalsequenzen in Kir2.1 dabei eine Rolle spielen. Folgende Beobachtungen unterstützen diese Annahme. 1. Hämagglutinin-markierte Kir2.1-Kanäle werden zeitabhängig endozytiert. Dabei wurden 5 min nach Induzierung der Endozytose durch Temperaturerhöhung ca. 20 % der Antikörper-markierten Kanäle von der Zelloberfläche internalisiert und nach 30 min wurde ein Maximum erreicht. Dies deutet darauf hin, dass Kir2.1 konstitutiv endozytiert wird. 2. Die Koexpression der dominant-negativen Endozytosefaktoren Dynamin-K44A und AP180C erhöhte die Oberflächenexpression von Kir2.1 um 40 % bzw. 49 %. In COS-7 Zellen inhibierte AP180C die Internalisierung von Kir2.1 um 80 % verglichen mit der Kontrolle. Diese Beobachtungen zeigen, dass Kir2.1 Clathrin-abhängig endozytiert wird. 3. Sowohl in Xenopus Oozyten als auch in Säugerzellen führte die Mutation der Tyrosine Y242 und Y341 zu einer signifikanten Erhöhung der Kir2.1 Oberflächenexpression durch eine starke Verringerung der Endozytoserate. Beide Tyrosine bilden jeweils ein klassisches, Tyrosin-basiertes Endozytosemotiv, 242YIPL245 und 341YSRF344, im C-Terminus von Kir2.1. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass beide Motive bei der Endozytose des Kanals eine wichtige Rolle spielen. 4. Lokalisationsanalysen von fluoreszenzmarkierten Kir2.1-Kanälen in lebenden Zellen zeigten eine klare Kolokalisation von Kir2.1 mit Markern für frühe (Rab5) und späte Endosome (Rab7) sowie Lysosome (LysoTracker), aber auch mit Markern für Recycling-Endosomen (Rab11). Dies verdeutlicht, dass Kir2.1 durch den endosmal-lysosomalen sowie den endosomalen-recycling Transportweg geschleust wird. 5. Die 3D-Struktur der zytosolischen Pore von Kir2.1 zeigt, dass die beiden Endozytosemotive, die in dieser Studie untersucht wurden, sich in räumlicher Nähe befinden. Da die Mutation von beiden Motiven einen ähnlichen Effekt auf die Oberflächenexpression hatte, wie die Mutation von einem der beiden Motive, liegt die Schlussfolgerung nahe, dass beide Motive eine Voraussetzung für die effiziente, konstitutive Endozytose von Kir2.1 sind.