Dual Role of Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in Melanoma: Autocrine and Paracrine Mechanisms on Tumor and Immune cells

Die vorliegende Arbeit basiert auf Untersuchungen von PACAP und PAC1R Expression und von den funktionalen Rollen von PACAP beim Melanom und Immunzellen. Im ersten Teil zeigt unsere Untersuchung die Expression von PACAP in primären und metastatischen Melanomgeweben. PACAP tritt in zwei Subtypen auf, PACAP 27 und PACAP 38. PACAP 38 scheint ausgeprägter in primären Melanomen aufzutreten, während in metastatischen Melanomen eine verstärkte Expression von PACAP 27 vorliegt. Ein weiteres interessantes Ergebnis ist die vorwiegende Expression von hoch-affinem PACAP-Rezeptor, PAC1R, in metastasierenden Melanomen, nicht aber in primären Melanomen. Die Co-Expression von PACAP 27 und PAC1R kann auch in den Zellinien von metastasierenden Melanomen nachgewiesen werden. Anhand dieser Resultate nehmen wir an, dass PACAP das Melanom in autokriner Weise regulieren kann. Die Wirkung von PACAP wurde bezüglich Zellwachstum und Cytokin-Produktion in Tumorzellinien untersucht. Zwei Melanom-Zellinien, SK-Mel 37 und NW-Mel 450 wurden ausgewählt, welche ähnliche Tumorantigene, wie NY-ESO/LAGE-1 und MAGE- 3 exprimieren, aber unterschiedliche Morphologie in Struktur und Größe aufweisen. Bei SK-Mel 37, deren Überleben deutlich von der Serumkonzentration abhängig ist, bewirkt die Zugabe von PACAP im Gegensatz zu NW-Mel 450, eine positive Regulation des Zellüberlebens oder -wachstums. Die Gen- oder Proteinexpression für Zellüberleben (BCL-2) sowie Zellproliferation (Ki67) wird durch PACAP induziert. Zusätzlich moduliert PACAP auch die Proteinexpression betreffend Zelldifferenzierung (z.B. MITF) und Chemokinrezeptor (z.B. CCR7) in Melanomen positiv. Die oben genannten Faktoren werden als eine wichtige Schaltstelle für die Malignität des Melanoms betrachtet. Auch die Zytokinproduction in beiden Melanom-Zellinien unterscheidet sich. SK-Mel 37 setzt IL-10 frei, während NW-Mel 450 IL-6 produziert. PACAP-Zugabe fördert die IL-6 Freisetzung aus NW-Mel 450, nicht aber die IL-10 Produktion aus SK-Mel 37. Diese Beobachtungen erläutern, dass trotz unterschiedlicher Regulation von PACAP auf Melanom-Zellinien, PACAP zur Förderung von Tumor-begünstigenden Funktionen führt. Im zweiten Teil der Arbeit zeigten PACAP-behandelte Immunzellen im Unterschied zu unbehandelten Zellen einen deutlichen Unterschied in Hinblick auf die immunsuppressive Regulation. Zwei isolierte T-Zell-Untergruppen, CD4+CD25+CD127low/- T-Zellen (regulatorische T-Zellen, Treg) und CD4+CD25- T-Zellen (Effektor oder Responder T-Zellen, Teff oder Tresp) wurden untersucht. Beide PACAP-behandelten T-Zell-Untergruppen erreichten nicht nur erhöhte Transkription spezieller Gene für die regulatorische Funktion, FoxP3 und CTLA-4, und für anti-inflammatorischen Zytokine, IL-10 und TGF-β, sondern auch eine erhöhte Genexpression von Chemokinrezeptoren, CCR4 und CCR7, die für die Wanderung der T-Zellen in bestimmte Gewebe verantwortlich sind. Interessanterweise kann eine stärkere Wirksamkeit von PACAP jedoch auf Treg im Vergleich mit den Teff/Tresp auf RNA-Ebene beobachtet werden. Diese Aktivität von PACAP wird überwiegend durch den Typ-II Rezeptor, VPAC1R, vermittelt, da auf CD4+ T-Zellen VPAC1R vorhanden sind. Weiterhin zeigt unser Experiment eine Expression von Typ-I Rezeptor, PAC1R, auf CD4+ T-Zellen nach der Aktivierung mit α-CD3/CD28 und PACAP-Zugabe. Dieses Resultat lässt uns vermuten, dass kontinuierlich freigesetztes PACAP aus Tumorzellen die PAC1R-Expression auf T-Zellen induziert. Entsprechend wurde in T-Zell-Suppressionstests ein stärker unterdrücktes Zellwachstum von Teff/Tresp in Co-Kultur mit Treg unter Zusatz von PACAP beoachtet. Zusammengefasst zeigen unsere Daten erstmals die Expression von PACAP und von hochaffinem PACAP Rezeptor, PAC1R, beim Melanom und die Fähigkeit von PACAP zur zellulären Aktivierung nicht nur des Zellwachstums und der Zytokinproduktion von Melanomzellen, sondern auch zur Verstärkung der charakteristischen Merkmale von Treg-Zellen. Daher könnte die Unterdrückung der PACAP-Wirkung beim Melanom eine wertvolle Strategie zur Beeinflussung des Krankheitsverlaufes werden. Somit ist es erforderlich, die PACAP-induzierten zellulären Mechanismen beim Melanom sowie die PACAP-vermittelte Regulation von Treg durch PAC1R genauer zu untersuchen.