Function of the ATP-dependent chromatin remodeler Mi-2 in the regulation of ecdysone dependent genes in Drosophila melanogaster

Die Entwicklung der Fruchtfliege Drosophila melanogaster wird durch das Steroidhormon Ecdyson reguliert. Ecdyson wird zu Beginn der Metamorphose sekretiert und initiiert eine Kaskade von transkriptionellen Ereignissen. Zunächst führt es zur Heterodimerisierung des Ecdyson Rezeptors (EcR) mit seinem Bindungspartner ultraspiracle. Dieser Komplex rekrutiert die Transkriptionsmaschinerie an Ecdyson induzierbare Gene und initiiert dadurch die Transkription von Genen, welche direkt zur Verpuppung und Metamorphose beitragen. ATP-abhängige Chromatinremodeler regulieren die Transkription in dem sie die Zugänglichkeit der DNA ändern und befinden sich in multimeren Proteinkomplexen befinden. Mi-2 ist ein Mitglied der CHD Familie der ATP-abhängigen Chromatin Remodeler und fungiert als Korepressor und Koaktivator in der transkriptionellen Regulation. Die in dieser Arbeit beschriebenen Resultate untersuchen die Funktion des Chromatin Remodelers Mi-2 in der Regulation von ecdysonabhängigen Genen. Diese Ergebniss führten zu einem Modell welches beschreibt, wie Mi-2 an hormonregulierte Gene bindet und die Transkription von ecdysonabhängigen Genen beeinflußt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden genomweite Mi-2 Bindungsstellen durch Chromatin-Immunopräzipitation gefolgt von DNA-Sequenzierung (ChIPSeq) in unbehandelten und ecdysonbehandelten Drosophila S2 Zellen kartiert. Dies führte zur Identifizierung von 103 Mi-2 Bindestellen, die verstärkte Bindung von Mi-2 nach hormoneller Stimulation zeigen. Weitere Analysen zeigten, dass ein signifikanter Anteil dieser Bindungsstellen in der Umgebung von ecdysoninduzierbaren Genen liegt, was eine Funktion von Mi-2 in der Regulation dieser Loci impliziert. Sechs ecdysoninduzierte Mi-2 Bindungsstellen an zwei ecdysonabhängigen Genen, broad und vrille, wurden eingehender untersucht. Hier führte Depletierung von Mi-2 zu einem starken Anstieg dieser Gene in unbehandelten und ecdysonbehandelten Zellen. Die Depletierung eines anderen ATP-abhängigen Chromatin Remodelers, Iswi, führte hingegen nicht zu einer Dereprimierung von broad und vrille. Dies deutet darauf hin, dass die Funktion von Mi-2 an den Genen broad und vrille spezifisch ist. Interaktionsstudien im zweiten Teil dieser Arbeit machten deutlich, dass Mi-2 an den EcR binden kann. Es wurde gezeigt, dass diese Interaktion unabhängig von dem Hormon Ecdyson ist. Desweiteren wurde die Interaktion zwischen Mi-2 und EcR auf die ATPase Domäne von Mi-2 kartiert. Diese Ergebnisse weisen zum ersten mal eine Interaktion zwischen der katalytischen Domäne von Mi-2 und einem Kernrezeptor nach. Zusätzlich dazu wurde beobachtet, dass die Aktivierungsfunktion 2 (AF2 Domäne) des EcR wichtig für die Interaktion mit Mi-2 ist. Die Erkenntnis, dass Mi-2 und EcR physisch interagieren können, führte zu der Hypothese, dass EcR Mi-2 an spezifische Stellen im Genom rekrutieren kann. In der Tat wurde ein signifikanter Überlapp zwischen Mi-2 und EcR Bindungsstellen, sowohl in unbehandelten als auch in ecdysonbehandelten Zellen, gefunden. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese, führte eine Depletierung von EcR zu einer verminderten, ecdysoninduzierten Rekrutierung von Mi-2 an die Gene broad und vrille. Diese Ergebnisse etablierten ein neues Modell für die Rekrutierung von Mi-2 durch den EcR an das Chromatin. Schließlich zeigten MNase Kartierungsstudien mit Mikrokokkus-Nuklease (MNase), dass Mi-2 durch die Aufrechterhaltung einer geschlossenen Chromatinsstruktur am vrille Gen fungiert. Hier führte eine Depletierung von Mi-2 zu einer geöffneten Chromatinstruktur, welche mit einer verstärkten Expression von vrille korrelierte.