Small RNA-guided processes in the hyperthermophilic methanogen Methanopyrus kandleri

In der vorliegenden Arbeit wurden RNAseq, sowie bioinformatische und biochemische Methoden angewandt um zelluläre Prozesse zu analysieren die von kleinen RNAs (sRNA) gesteuert werden. Um zu untersuchen, wie diese Prozesse bei extremen Temperaturen funktionieren, wurde das hyperthermophile Archaeon Methanopyrus kandleri, welches bei Temperaturen von bis zu 110°C lebt, als Modellorganismus verwendet. Das Genom von M. kandleri enthält zwei CRISPR-Cas Systeme, welche crRNAs (CRISPR RNAs) als Zielerkennungsmoleküle verwenden, um sich gegen Viren zur Wehr zu setzen. Durch RNAseq Analysen wurden große Mengen an prozessierten crRNAs detektiert. Dies deutet darauf hin, dass CRISPR-Cas Systeme bei extremer Temperatur sehr aktiv sind. Zudem wurde die Kristallstruktur des CRISPR-assoziierten Proteins Csm3 in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Elena Conti (MPI Martinsried) aufgeklärt. Anhand von RNA Bindestudien wurde Csm3 als crRNA-bindendes Protein identifiziert, welches als Gerüstprotein des Typ III-A CRISPR-Cas Interferenzkomplexes fungiert. Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass pAgo (prokaryotic Argonaute) Proteine kurze Nukleinsäuresequenzen verwenden, um Zielmoleküle zu erkennen. In M. kandleri, ist ein solches pAgo Protein in einem potentiellen Operon zusammen mit Proteinen des CRISPR-Cas Systems kodiert. Versuche pAgo rekombinant herzustellen wiesen auf eine hohe Toxizität des Proteins in Escherichia coli hin, was mit einer möglichen Abwehrfunktion gegen Plasmid DNA in Zusammenhang stehen könnte. Die Methylierung von RNA Molekülen wird durch einen anderen Prozess gesteuert, welcher C/D Box sRNAs als Zielerkennungssequenzen verwendet, um Ribonukleoproteinkomplexe an Methylierungsstellen ribosomaler RNAs zu führen. In M. kandleri wurde eine Rekordzahl von 126 C/D Box sRNAs durch RNAseq Analysen detektiert, welche auf eine erhöhte Methylierung von rRNAs hinweist. Zudem wurde ein Großteil der C/D box sRNAs als zirkuläre Moleküle detektiert. Zusammenfassend können die Zirkularisierung von C/D Box sRNAs und der erhöhte Bedarf an RNA Methylierungen als Adaptionen an die hyperthermophile Lebensweise von M. kandleri angesehen werden. Abschließend wurden durch RNAseq Analysen tRNA-Vorläufer Moleküle identifiziert, welche die nur in M. kandleri vorkommende C-zu-U Modifikation der Base 8 aufwiesen. Das Auftreten dieser Modifikation wurde genutzt, um daraus Rückschlüsse auf die Reihenfolge von tRNA Prozessierungsschritten in nicht kompartimentierten Zellen zu schließen. Unsere Analysen ergaben, dass das Beschneiden der Enden dem Entfernen von Introns, sowie der Editierungsreaktion vorrausgeht.