Decipering the subunit interaction in the crenarchaeal archaellum

Die archaeale Fortbewegungstruktur, das Archaellum ist ein faszinierendes Hybrid, welches die Funktion einer bakteriellen Flagelle aber die Architektur eines Type IV Pilus (T4P) in sich vereint. Aufgrund seiner rotierenden Eigenschaft ist dieser T4P ein erstaunliches Beispiel der evolutionären Anpassung und stellt eine neue bisher unbekannte Art sich zu bewegen dar. Trotz dem Wissen über die Beweglichkeit einzelner Archaeen von über 20 Jahren, konnte durch das Fehlen genetischer Methoden in Archaeen die genaue Struktur dieser Fortbewegungseinheit sowie die zugehörigen Gene nicht identifiziert werden.. Alle bisher durchgeführten Studien zur physiologischen und genetischen Analyse des Archaellums sind auf wenigen Euryarchaeota Arten beschränkt. In dieser Studie präsentieren wir eine detaillierte, systematische sowie strukturelle Analyse des crenarchaealen Archaellums aus dem thermoacidophilen Sulfolobus acidocaldarius. Das Archaellum von S. acidocaldarius besteht aus nur sieben elementaren Untereinheiten und repräsentiert damit das minimalistischste der bekannten Archaella Systeme. Deletionsanalysen ergaben, dass alle der sieben fla-Gene essentiell für die ordnungsgemäße Assemblierung des Archaellums sind. Ferner waren alle diese fla-Mutanten unbeweglich, wodurch die Funktion der Fla- Proteine für die Motilität bewiesen wurde. Darüber hinaus konnte mit Immunoblot Analyse gezeigt werden, dass die Biosynthese des Archaellum unter nährstofflimitierten Bedingungen induziert wird. Obwohl sich alle sieben fla-Gene hintereinander in einem genomischen Locus befinden, konnte gezeigt werden, dass zwei verschiedenen Transkriptionseinheiten exprimiert werden. So werden das Archaellin FlaB und die restlichen Komponenten FlaBXHGFHIJ separat synthetisiert. Der Schwerpunkt dieser Arbeit fokussierte sich auf die strukturelle Analyse des Archaellums von S. acidocaldarius. So wurden detaillierte biochemische und strukturelle Charakterisierungen der beiden cytoplasmatischen Komponenten des Archaellums, die RecA Proteine FlaH und der ATPase FlaI durchgeführt. Durch die Aufklärung des Interaktionsnetzwerks von FlaH, FlaXund FlaI, konnten wir diese Proteine als strukturelle Komponenten des basalen Körper zusammen mit FlaJ identifizieren. Aufgrund dieser biochemischen Analysen konnte ein Model der Archaellum Assemblierung entwickelt werden, in dem das Transmembranprotein FlaJ als Montageplattform dient, welches die ATPase FlaI zur Membran rekrutiert. Dieser FlaI/FalJ Komplex wird von FlaX in Form einer riesigen Ringstrukturen umgeben, welche direkt mit FlaI interagiert. Aufgrund von Affinitätsstudien von FlaH mit FlaX und FlaI konnte die Bindung zu den beiden Strukturproteinen nachgewiesen werden.. Aufgereinigte ATPase FlaI konnte erfolgreich kristallisiert werden, wodurch seine hexamere Struktur mit einer Auflösung von 2,0 Å aufgeklärt werden konnte. Die Hexamere von FlaI bilden eine kronenartige Struktur, dessen Untereinheiten sich in drei verschiedenen Konformationen befinden können und in einer seltenen Queruntereinheit Interactions Weise zusammengebaut sind. Durch Deletionsstudien konnte weiter gezeigt werden, dass FlaI die erzeugte Energie sowohl für die Assemblierung des Archaellums so wie auch für dessen Rotation bereitstellt. Durch die Deletion der ersten 29 Aminosäuren des N-Terminus von FlaI konnte das Filament noch zusammengebaut, allerdings nicht mehr rotiert werden. In vivo und in vitro Analyse von FlaH zeigten, dass FlaH ein gut konserviertes Walker A allerdings nur ein unvollständiges Walker-B-Motiv hat, beide Motive sind wichtig für die ATP-Bindung und Hydrolyse. Da keine ATPase-Aktivität festgestellt werden konnte, wurde FlaH als ein ATP-bindendes Protein gekennzeichnet Die Kristallstruktur von FlaH konnte mit 2,3 Å auflöst werden. Diese Kristallstruktur enthielt ein gebundenes ATP-Molekül, wodurch zusätzlich bestätigt wurde, dass FlaH ATP nicht hydrolysieren kann. Strukturelle Ähnlichkeiten mit der CII-Domäne von KaiC suggerierten, dass FlaH ein Phosphorylierung abhängiger Regulator für die Assemblierung und Funktion des Archaellums sein kann. Dieser Verdacht wird weiter durch die Auto-Phosphorylierungs Aktivität von FlaH verstärkt. Zusammenfassend, geben die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse neue Einblicke in die genomische Organisation und einzigartige molekulare Architektur des Archaellums von S. acidocaldarius. Außerdem konnten durch die hier dargestellte Strukturanalysen, Unterschiede zwischen den Motorproteinen des Archaellums und des bakteriellen Flagellums, aufgezeigt werden.