Autophagy and apoptosis contribute to neuronal survival in a model system of oxytosis in vitro

Autophagie und Apoptose sind hochregulierte, komplexe Mechanismen, die eine bedeutende Rolle in der Entwicklung, Funktion und Homöostase von Zellen und Geweben eines Organismus einnehmen. Apoptose ist durch die Aktivität spezifischer Enzyme, der Caspasen, gekennzeichnet, die festgelegte programmierte Signalkaskaden in Gang setzten, was u.a. einen schnellen Abbau von Organellen und anderen zellulären Strukturen zur Folge hat. Autophagie ist ein hoch konservierter und in der Regel protektiver Prozess, bei dem zytoplasmatische Bestandteile in so genannte Autophagosomen eingeschlossen und transportiert werden und schließlich in den in Lysosomen degradiert werden. Bei neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Parkinson, Morbus Alzheimer und akuten Gehirnerkrankungen sind in den letzten Jahren zunehmend auch Mechanismen der Autophagie und Apoptose detektiert worden. Diese Befunde führten zu der Schlussfolgerung, dass bei diesen Erkrankungen die erhöhte Aktivität von Apoptose und Autophagie zum fortschreitenden Zelltod der Neurone und dem progressiven Verlust der Hirnfunktionen essentiell beitragen. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, die möglichen Funktionen von Autophagie und Apoptose in Modellsystemen von Glutamat-Toxizität in kultivierten Neuronen in vitro zu untersuchen, um die Rolle dieser Mechanismen beim neuronalem Zelltod zu klären. Die Rolle von Autophagie wurde im Modellsystem von Glutamat-induziertem oxidativem Stress in neuronalen HT-22 Zellen untersucht. Eine Zielsetzung war, den Effekt von oxidativer Glutamat-Toxizität auf die Aktivierung von Autophagie-Mechanismen in den Neuronen zu bestimmen und so zu klären, ob und in welchem Ausmaß hier Autophagie zum Zelltod beiträgt. Zudem wurde in Modellsystemen der Glutamat-Toxizität auch der neuroprotektive Effekt des vielfach verwendeten Autophagie-Inhibitors 3-Methyladenin (3-MA) untersucht. In HT-22 Zellen und primären kortikalen Neuronen (PCN) war die Glutamat-induzierte Toxizität von einem deutlichen Anstieg von Autophagie-Markern begleitet. Der Glutamat-induzierte Zelltod wurde durch den Autophagie-Inhibitor 3-MA signifikant vermindert. Allerdings induzierte 3-MA selbst Autophagie in HT-22 Zellen. Im Gegensatz dazu gelang es nicht, die Zellen mit Hilfe von genetischer Regulation der Autophagie gegen die Glutamat-Schädigung zu schützen. Die siRNA-vermittelte Expressionshemmung von Schlüsselregulatoren der Autophagie reduzierte zwar erwartungsgemäß die autophagische Aktivität, war aber nicht in der Lage, den Zelltod dauerhaft aufzuhalten. Der Inhibitor 3-MA verhinderte zudem die Glutamat-induzierte Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies und den Verlust von ATP, wobei sowohl das Mitochodrienmembranpotential als auch die mitochondriale Morphologie erhalten blieben. Die Aktvierung der PI3K/Akt- und der MAPK/Erk-1/2 Signalwege sind offenbar nicht an der 3-MA vermittelten Neuroprotektion beteiligt. Schlussfolgernd zeigen diese Daten, dass Glutamat-Toxizität mit einer Aktivierung der Autophagie einhergeht. Allerdings lieferte die siRNA-vermittelte spezifische Hemmung der Expression von Schlüsselregulatoren der Autophagie keine protektiven Effekte, so dass die gemessene autophagische Aktivität nicht entscheidend zum Glutamat-induzierten Zelltod beiträgt. Die Induktion von Autophagie ist in diesem Zusammenhang offenbar eine Gegenregulation der Zellen, über die eine Anpassung an den Stress vermittelt wird. In den untersuchten Neuronen trägt die Autophagie eher zum Überleben und zur zellulären Homöostase bei und ist nicht als Mechanismus des Zelltodes zu verstehen. Weiterhin zeigen die Ergebnisse, dass der protektive Effekt von 3-MA in den Mitochondrien der Neurone unabhängig von einer Inhibition der Autophagie erfolgt, obwohl die Substanz vielfach als Inhibitor der Autophagie verwendet wird. Basierend auch auf den vorliegenden Ergebnissen sind also Daten, die mit 3-MA in Autophagiestudien erhoben werden, zurückhaltend zu interpretieren, insbesondere dann, wenn mitochondriale Schädigungen den Zelltod vermitteln. Der Beitrag von Apoptose zu neuronalem Überleben durch interzelluläre Signale zwischen sterbenden (Stamm) Zellen und Neuronen wurde in Modellen des Nährstoffentzugs in neuronalen Vorläuferzellen und im Glutamat-Schädigungsmodell in den HT-22 Zellen untersucht. Therapeutische Effekte von Stammzellen und neuronalen Vorläuferzellen sind in Modellsystemen von akuten und chronischen neurodegenerativen Erkrankungen umfangreich nachgewiesen worden. In experimentellen Studien steigerten beispielsweise entsprechende Zelltransplantate das neuronale Überleben und die Erhaltung und Regeneration von Gehirnfunktionen. Jedoch sterben die meisten Zellen nach der Transplantation in das Gehirngewebe schnell ab und auch der exakte Mechanismus der therapeutischen Effekte von solchen Zelltransplantationen ist bislang weitgehend unbekannt. Die vorliegende Arbeit untersuchte, inwieweit das Absterben von neuronalen Vorläuferzellen für die beobachteten protektiven Effekte von transplantierten Zellen von Bedeutung ist. Zu diesem Zweck wurden die Transplantationsbedingungen in vitro nachgeahmt indem aus dem Medium von neuronalen Vorläuferzellen (NPC) die Wachstumsfaktoren EGF und FGF entfernt wurden, um so apoptotischen Zelltod zu induzieren. Das konditionierte Medium von diesen apoptotischen Zellen sollte ähnliche zelluläre Komponenten enthalten, die auch nach der Transplantation von den sterbenden Stamm- oder Vorläuferzellen im Gehirn in vivo freigesetzt werden und die möglicherweise die neuroprotektiven Effekte vermitteln. Das konditionierte Medium der apoptotischen neuronalen Vorläuferzellen wurde im Modell der Glutamatschädigung in HT-22 Zellen auf neuroprotektive Effekte untersucht. Weiterhin wurde die Zusammensetzung des konditioniertem Mediums der sterben Progenitorzellen analysiert, um die wirksamsten protektiven Komponenten zu identifizieren, die dann vielleicht in vitro und in vivo an Stelle des konditionierten Mediums oder zellulärer Transplantate appliziert werden könnten. Der Wachstumsfaktorentzug induzierte in den NPC einen Caspase-abhängigen Zelltod. Das konditionierte Medium (CM) von den apoptotischen NPC zeigte deutliche dosisabhängige protektive Effekte und verhinderte in HT-22 Zellen und kortikalen Neuronen den Zelltod nach Wachstumsfaktorentzug und Glutamatbehandlung. Der protektive Effekt des konditionierten Mediums wurde durch Hitzeinaktivierung bei 95°C für 30 Minuten aufgehoben. Weiterhin verstärkte das CM die Phosphorylierung von Erk 1/2 und PKB/Akt in primären Neuronen in einem ähnlichen Zeitrahmen wie das Neurotrophin BDNF. Autophagieinhibition in NPC schwächte die beschriebene neuroprotektive Wirkung nicht ab. Konditioniertes Medium, das von den NPC nach Induktion von Autophagie durch Spermidin gewonnen wurde, zeigte keinerlei protektiven Effekte in dem Modell der Glutamat-Schädigung in HT-22 Zellen. Die Aktivierung von Autophagie in NPC ist also im Gegensatz zur Apoptose offenbar nicht ausreichend, um protektive Faktoren zu bilden und in das konditionierte Medium abzugeben. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass apoptotische NPC neuroprotektive Faktoren sezernieren, die neurotrophin-ähnliche Überlebenssignalwege stimulieren und so protektive Effekte gegen Nährstoffentzug und Glutamat-Toxizität vermitteln. Die Resultate des in vitro Modellsystems in dieser Arbeit sind übertragbar zum adulten Organismus. Die vorliegenden Erkenntnisse sind die Basis für die Entwicklung einer zellfreien, standardisierten und potenten neuroprotektiven Komposition, die eine Alternative zur Stammzelltransplantation darstellt und neue therapeutische Optionen für die zukünftige Behandlung von akuten und chronischen neurodegenerativen Erkrankungen bieten kann.