An alternative secretory pathway in the malaria parasite Plasmodium falciparum

Der Malariaerreger P. falciparum befällt rote Blutkörperchen im Menschen. Bei der Invasion der Erythrozyten formt der Parasit eine sogenannte parasitophore Vakuole (PV), die ihn dann umgibt. Der Parasit verbleibt und entwickelt sich in dieser PV, die ihn vom Zytosol der Wirtszelle schützt. Während des intraerythrozytären Wachstums exportiert der Parasit eine hohe Anzahl seiner eigenen Proteine in die Wirtszelle um sein Überleben in der Wirtszelle zu sichern. Proteine, die entweder in das Zytosol oder der Membran der Wirtszelle exportiert werden, müssen zunächst die Plasmamembran des Parasiten (PPM), die PV und die anliegende parasitophore Vakuolenmembran (PVM) passieren. Der Sekretions- und Exportmechanismus vieler Parasitenproteine ist jedoch noch immer unbekannt. Ziel dieser Arbeit ist es alternative Sekretionswege zum klassichen ER/Golgi Sekretionsweg im Malariaparasiten P. falciparum aufzudecken. Zwei Proteine schienen geeignete Kandidaten eines alternativen Sekretionsweges zu sein: der PfADPRibosylierungsfaktor 1 (ARF1) und die PfAdenylat kinase 2 (AK2). Beide Proteine besitzen eine N-myristoylierungsstelle am N-terminus was auf eine N-myristoylierung des jeweiligen Proteins hindeutet. N-myristoylierung ist eine ko-translationale Modifizierung eines Proteins, wobei eine Fettsäure (Myristat) irreversibel am Glycinrest am N-terminus eines Proteins durch die PfN-myristoyltransferase (NMT) angehängt wird. Eine vorangegangene Proteomuntersuchung der parasitophoren Vakuole und eine Untersuchung mit Reporterkonstrukten ergab für PfARF1 (Proteomuntersuchung) und PfAK2 (Analyse der Reporterkonstrukte) eine PV Lokalisation, obwohl beiden ein Signalpeptid fehlt. Deshalb wurde die Hypothese aufgestellt, dass N-myristoylierung womöglich an der Proteinsekretion über die Plasmamembran des Parasiten beteiligt sein könnte. Demnach wurde die subzelluläre Lokalisation der PfARF1/GFP Parasiten und der PfAK2/GFP Parasiten mithilfe von Epifluoreszenzmikroskopie und biochemischen Methoden untersucht. Parallel dazu wurden Reporterkonstrukte generiert und analyisert, bei denen die N-myristoylierungsstelle von PfARF1 (diese Arbeit) und PfAK2 (Ma et al., 2012) entfernt wurden (PfARF1G2A/GFP und PfAK2G2A/GFP). Beim live cell imaging war das Fusionsprotein ARF1/GFP als punktförmige Struktur im Parasiten erkennbar. Der Phänotyp des Fusionsproteins der PfARF1G2A/GFP Parasiten dagegen zeigte ein zytosolisches Signal im Parasiten. Weitere Analysen im Hinblick auf die subzelluläre Lokalisation des PfARF1 deuten auf eine Lokalisation dieses Proteins mit Kompartimenten des frühen Sekretionsweges des Parasiten hin jedoch auf keine Lokalisation in der PV. Im Gegensatz dazu war das Fusionsprotein PfAK2/GFP als ringförmige Struktur sichtbar was auf eine PV Lokalisation hindeutet. Die PfAK2G2A/GFP Parasiten zeigten hingegen eine zytosolische Lokalisation des Fusionsproteins (Ma et al., 2012). Biochemische Untersuchungen konnten zeigen, dass das Fusionsprotein PfAK2/GFP in Anwesenheit der N-myristoylierungsstelle in die PV sekretiert wurde. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der N-terminus von PfAK2 das Protein zur Plasmamembran führt und eine stabile Membranverankerung hervorruft bevor die Translokation über die Plasmamembran des Parasiten erfolgt. Eine mögliche Rolle des frühen Sekretionsweges im Transport von PfAK2 und der Faltungszustand von PfAK2 vor der Translokation über die Parasitenplasmamembran wurden ebenfalls untersucht. Dennoch ist der genaue Mechanismus der Proteintranslokation über die Plasmamembran des Parasiten nicht bekannt.