Biochemical characterization of the relaxase TraI, the coupling protein TraD and the hypothetical protein Yaf of the novel Type IV Secretion System from the human pathogen Neisseria gonorrhoeae

Typ IV Sekretionssysteme (T4SSs) transportieren DNA und verschiedenen Effektorproteine über die innere und äußere Zellmembran von Prokarioten. Sie bestehen aus einem Transportkomplex, dem sogenannten MPF-Komplex („mating pair formation“), der einen Kanal durch die innere und äußere Membran bildet und aus DNA Prozessierungs- und Transferproteine (Dtr Proteine). Ein neues und bisher einzigartiges T4SS ist innerhalb des „gonococcal genomic island“ lokalisiert, welchen in den meisten Neisseria gonorrhoeae Stämmen vorkommt. Dieses T4SS ist das erste T4SS, das einzelsträngige DNA in allen Wachstumsphasen direkt in seine Umgebung sekretiert. Diese Eigenschaft macht das T4SS von N. gonorrhoeae zu einen vielversprechendem Forschungsobjekt für Studien über den Transportmechanismus von T4SSs. Das GGI-T4SS besteht aus einem MPF-Komplex, der große Ähnlichkeit mit dem MPF-Komplex des F-Plasmides von E. coli hat (die sogenannte MPFF Familie), und aus Dtr Proteinen die zu der MOBH Familie der Prozessierungs- und Lokalisationsfaktoren gehören. Um die Verteilung und Konservierung GGI ähnlicher T4SSs zu untersuchen wurden mittels bioinformatischer Analysen ähnliche T4SSs aus allen derzeitig sequenzierten Genomen und Plasmiden identifiert. Neben dem T4SS aus N. gonorrhoeae wurde weitere ähnlich konservierte T4SSs in anderen Bakterien identifiziert. Diese T4SSs sind entweder genomisch oder befinden sich auf Plasmiden. Die meisten der GGI Gene innerhalb der Region zwischen ltgX und exp1 kodieren für MPFF Proteine und sind hoch konserviert in allen identifizierten T4SSs, auch wenn einige dieser Gene nicht in den Transfer von Einzelstrand-DNA involviert sind. Bemerkenswerterweise enthalten alle identifizierten genomischen T4SSs mpf Gene der MPFF Familie und dtr Gene der MOBH Familie; die Plasmid-kodierten T4SSs hingegen enthalten mpf Gene der MPFF Familie und dtr Gene der MOBF Familie. Die zeigt, dass Relaxasen der MOBH Familie hauptsächlich in genomischen T4SSs vorhanden sind. Um den Mechanismus der DNA Prozessierung des einzigartigen T4SSs aus N. gonorrhoeae zu studieren wurden in dieser Arbeit die Schlüsselenzyme TraD (das Kopplungsprotein), TraI (die Relaxase) und das hypothetische Protein Yaf aus N. gonorrhoeae biochemisch charakterisiert. Die Überexpression und die Aufreinigung von Kopplungsproteinen und Relaxasen von T4SSs ist eine schwierige Herausforderung und obwohl viele verschiedene Versuche unternommen wurden um TraD rekombinant in E. coli zu überexprimieren, war es nicht möglich lösliches Protein zu isolieren. Stattdessen wurden große Mengen von Einschlusskörperchen gebildet. Kleine Mengen von TraD wurden in isolierten inneren Zellmembranen von E. coli detektiert, allerdings konnte dieses Protein nicht aus den Membranen herausgelöst werden. Schließlich wurde TraD unter dentaurierenden Bedingungen aus Einschlusskörperchen isoliert und aufgereinigt, allerdings schlugen alle weiteren Neufaltungsversuche fehl und führten entweder zum Verlust des Proteins oder zu Aggregation. Deshalb war es nicht möglich die enzymatische Aktivität des neisserialen Kopplunsproteins zu charakterisieren. Das hypothetische Protein Yaf konnte erfolgreich in großen Mengen isoliert werden und bildet in Lösung ein Gleichgewicht zwischen verschiedenen oligomeren Stadien. Hauptsächlich werden jedoch Dimere gebildet. Das Gleichgewicht zwischen den verschiedenen Oligomeren wird deutlich von der Proteinkonzentration und den jeweiligen Pufferbedingungen beeinflusst. Die Umwandlung der einzelnen Oligomerstadien ist ein langsam verlaufender Prozess. Die Anwesenheit eines N terminalen His-tags hat einen stabilisierenden Effekt auf die tetramere Form. Limitierte Proteolyse mit Trypsin zeigte eine hohe Resistenz von Yaf gegenüber Trypsin, was auf eine hohe strukturelle Stabilität von Yaf hindeutet. Tetramere zeigten hierbei eine größere Resistenz gegenüber der proteolytischen Aktivität von Trypsin als Dimere. Erstaunlicherweise führten Punktmutationen innerhalb der Sequenze von Yaf zu einer Destabilisierung des Proteins und die Mengen an löslichem Protein waren stark reduziert. Mit Hilfer verschiedener Aktivitätsmessungen wurde die Funktion von Yaf untersucht. DNA-Bindungsversuche haben gezeigt, dass dimeres und tetrameres Yaf doppelsträngige DNA Substrate mit geringer Affinität (>5 µM) bindet. Desweiteren wurde in Elutionsfraktionen mit dimeren und tetrameren Yaf eine Metall-abhängige und Sequenz unabhängige Nukleaseaktivität beobachtet. Diese Nukleaseaktivität war spezifisch für doppelsträngige DNA Fragmente und für Oligonukleotide mit Sekundärstrukturen. In der Anwesenheit von verschiedenen divalenten Metallionen konnte innerhalb der Elutionsfraktionen mit dimerem und tetramerem Yaf eine Relaxierungsaktivität auf superspiralisierte Plasmide beobachtet werden. Diese Reaktion war besonders verstärkt in Anwesenheit von Mn2+ und Co2+, konnte aber auch in Anwesenheit von Mg2+ beobachtet werden. Um Informationen über den strukturellen Aufbau und über die Funktion von Yaf zu erhalten, wurde die Kristallisation von Yaf in Zusammenarbeit mit Dr. S. Smits aus der Forschungsgruppe von Prof. L. Schmitt (Heinrich Heine Universität in Düsseldorf) begonnen. Kristalle, die aus Yaf mit einem N-terminalen His-tag bestehen, streuen zurzeit bis zu einer Auflösung von 3 Å. Zudem konnte kürzlich erstes Wachstum von Protein-Kristallen mit inkorporiertem Selenomethionin beobachtet werden. Natives Yaf kristallisiert jedoch nicht unter den gleichen Bedingungen wie Yaf mit einem N-terminalen His-tag. Um die MOBH Relaxase TraI funktionell zu charakterisieren wurden viele verschiedene Überexpressionsmethoden und Reinigungsprotokolle getestet. Schließlich konnten eine Überexpressionsmethode und ein Reinigungsprotokoll etabliert werden, mit denen erfolgreich lösliches TraI isoliert werden konnte. TraI bildet in Lösung stabile Dimere und limitierte Proteolyse zeigte, dass TraI aus mindestens drei unterschiedlichen Trypsin-resistenten Domänen besteht. DNA Bindgungsversuche haben gezeit, dass TraI doppelsträngige und einzeilsträngige DNA mit hoher Affinität in einer Sequenz-unabhängigen Reaktion bindet. Die minimale Bindungslänge von einzelsträngigen DNA Substraten, die für eine Bindung mit TraI nötig ist wurde auf 9 Nukeotide bestimmt. Desweiteren wurde für TraI eine Metall-abhängige und Sequenz-unabhängige Relaxierungsaktivität auf superspiralisierte Plasmide beobachtet. In Anwesenheit von Mn2+ ist diese Aktivität deutlich gesteigert. Die Relaxierungsaktivität von TraI ist ähnlich zu der enzymatischen Aktivität von Topoisomerase I aus E. coli, unterscheidet sich aber von dieser bezüglich des bevorzugten Metall-Cofaktors und durch die tatsache, dass bei der Reaktion von TraI keine detektierbaren Topoisomerasen I-typischen Intermediate während der Reaktion beobachtet wurden. Experimente zur DNA-Strangspaltungsaktivität von TraI wurden mit unterschiedlichen einzel-strängigen DNA Substraten durchgeführt. Dabei wurde ein TraI induzierte Strang-spezifische Spaltung bei zwei Oligonukleotiden beobachtet, die abhängig ist von Mn2+. TraI spaltet einzelsträngige DNA Substrate, die entweder die Sequenze der oriT Region des GGI enthalten oder die Sequenz der oriT Region des F-Plasmides aus E. coli. Dazu komplementäre Stränge und ein polyT Oligonukleotid wurden nicht von TraI gespalten. Ein Vergleich der beiden postulierten Spaltstellen in den Oligonukleotiden ergab keine Ähnlichkeiten zwischen den beiden Sequenzen. Um strukturelle Informationen über TraI zu erhalten, wurden die Kristallisation von TraI in Zusammenarbeit mit Dr. S. Smits aus der Forschungsgruppe von Prof. L. Schmitt (Heinrich Heine Universität in Düsseldorf) initialisiert. Neben der Charakterisierung der enzymatischen Aktivität von TraI und Yaf wurde mit „pull-down“ Versuchen untersucht, ob beide Proteine miteinander oder ob sie mit mit der neisseriellen T4SS ATPase TraC interagieren. Die Ergebnisse zeigten jedoch keine Interaktion zwischen diesen drei Proteinen. Die Ergebnisse dieser Studie führen dazu, ein besseres Verständnis bezüglich des DNA Prozessierungsmechanismus des einzigartigen T4SS von N. gonorrhoeae zu erhalten. Bedeutende Fortschritte wurden bei der funktionellen Überexpression und der Aufreinigung von TraI und Yaf erzielt. Die, in dieser Studie erzielten Ergebnisse der biochemischen Charakterisierung von TraI repräsentieren die ersten verfügbaren biochemischen Daten über diese neue Relaxase-Familie. Desweitern ermöglicht diese Studie erstmals Einblicke in die enzymatische Aktivität des nicht charakterisierten hypothetischen Proteins Yaf, obwohl die eigentliche Funktion dieses Proteins noch immer unbekannt ist.