Metatranscriptome analysis of microbial communities in rice microcosms

Metatranskriptomik ist eine ‘state-of-the-art’ Technik um die funktionellen Aktivitäten mikrobieller Gemeinschaften aufzuklären. Die Anwendung hat sich bis auf wenige Ausnahmen bis jetzt auf marine Lebensräume fokussiert. In meiner Doktorarbeit haben wir den gesamten Ablauf der Metatranskriptomik, einschließlich RNA Extraktion, Vorbereiten von cDNA Bibliotheken mittels Zufalls-priming, 454 Pyrosequenzierung und bioinformatische Analyse für terrestrische Lebensräume etabliert. Der gesamte, entwickelte Ablauf wurde bezogen auf mikrobielle Gemeinschaften in oxischer- und anoxischer Erde von Reisbodenmikrokosmen umfassend getestet. Gesamt-RNA von hoher Integrität und Reinheit konnte bei einem pH Wert von 5 mittels Phenolextraktion kombiniert mit Q-Sepharose Säulenchromatographie gewonnen werden. Durch Anwendung des Ribo-Zero ™ rRNA removal kits (Meta-Bacteria) war es uns möglich mRNA bis zu einem Grad von 50-70% in unseren Metatranskriptombibliotheken anzureichern. Alle erhaltenen 454 reads sind vor der eigentlichen Datenverarbeitung vorverarbeitet worden um potentielle Unklarheiten auszuräumen. Insgesamt 10,000 SSU-ribotags (Gesamt-RNA) sind analysiert worden um die Gemeinschaftsstruktur in den oxischen und anoxischen Zonen an drei unterschiedlichen Inkubationszeitpunkten (25, 45 und 90 Tage, nach dem Pflanzen von Reiskeimlingen) aufklären zu können. Zusätzlich konnten 45,000 beziehungsweise 12,000 mRNA-tags (angereicherte mRNA) für die Analyse funktioneller Aktivitäten, bezogen auf die oxische und anoxische Zone 90 Tage alter Reismikrokosmen gewonnen werden. Die Analyse der SSU-ribotags hat keine gravierenden Veränderungen der mikrobiellen Gemeinschaften gezeigt, mit Ausnahme von Geobacter, Clostridien und Methanogenen in der anoxischen Zone. Nichtsdestotrotz konnte belegt werden das klare taxonomische Unterschiede zwischen der oxischen und anoxischen Zone vorliegen, wobei Cyanobakterien die dominierende Gruppe der oxischen Zone darstellen. Obwohl mRNA-tags bezogen auf grundlegende zelluläre Funktionen das Gros in beiden Datensätzen ausmachten, konnten spezifische Funktionen in Abhängigkeit zur Verfügbarkeit von Sauerstoff gezeigt werden. So zum Beispiel Zusammenfassung VI Methanoxidierung in der oxischen Zone und Methanogenese unter anoxischen Bedingungen. Der von uns etablierte Ansatz der Metatranskriptomik stellt ein nützliches Mittel dar um die Zusammensetznung und funktionelle Genexpression von komplexen, terrestrischen mikrobiellen Gemeinschaften untersuchen zu können, ohne den Beschränkungen PCR-basierter Techniken zu unterliegen.