Ribosome-Independent Biosynthesis of Peptide Natural Products: Nonribosomal Peptide Synthetases and Cyclodipeptide Synthases

Bioaktive Peptid-Naturstoffe spielen weiterhin eine wichtige Rolle in der modernen Medizin, wo sie oftmals als letzte Option bei schweren, lebensbedrohlichen Erkrankungen eingesetzt werden. Ein großer Teil dieser Peptide wird in der Natur, unabhängig vom Ribosom, durch Templat-abhängige und Templat-unabhängige sekundäre Stoffwechselwege synthetisiert. Oftmals sind diese strukturell komplexen Peptid-Naturstoffe nicht durch rein synthetische Ansätze zugänglich. Deshalb wurde damit begonnen neue Ansätze für in vivo Fermentationsprozesse, sowie chemoenzymatische Strategien zur Synthese und Diversifikation von Peptid-Naturstoffen zu entwickeln. Diese Ansätze fußen auf einem vertieften Verständnis der zugrundeliegenden biosynthetischen Stoffwechselwege. In dieser Arbeit wurden aus diesem Grund jeweils zwei Templat-abhängige und Templat-unabhängige Biosyntheserouten eingehend untersucht. Hierbei standen sowohl die Mechanismen, welche zur Synthese eines bestimmten Peptidgerüsts führen, sowie die zugehörigen Modifizierungsstrategien, die das assemblierte Peptid weiter dekorieren, im Fokus. Bei den beiden untersuchten Templat-abhängigen NRPS-Biosynthesewegen handelt es sich um die Assemblierungsrouten des Antitumor-Antibiotikums Sibiromycin und des neu identifizierten Siderophors Mirubactin. Es wurde durch detaillierte in vitro Studien gezeigt, dass die ungewöhnlich substituierte Anthranilsäure-Gruppe des Sibiromycins durch vier biosynthetische Schritte generiert wird. Ausgehend von 3-Hydroxykynurenin wird durch die SAM-abhängige Methyltransferase SibL eine Methylierung an der 4-Position eingeführt. Die PLP-abhängige Kynureninase SibQ erzeugt anschließend 3-Hydroxy-4-methylanthranilsäure (3H4MAA) durch Hydrolyse. Dieses Intermediat dient nun als Substrate für die NRPS SibE, welche es aktiviert und kovalent an seine Thiolierungsdomäne bindet. Abschließend wird die vollständig modifizierte Anthranilsäure-Gruppe durch online-Hydroxylierung, katalysiert durch die FAD/NADH-abhängige Hydroxylase SibG, gebildet. Das vormals unbekannte Siderophor Mirubactin konnte aus Actinosynnema mirum durch Kultivierung unter Eisen-limitierten Bedingungen, gefolgt von Aktivitäts-geleiteter Aufreinigung, isoliert werden. Durch eine Kombination an spektroskopischen, massenspektrometrischen und Derivatisierungs-Methoden, konnte die Struktur von Mirubactin aufgeklärt werden. Durch bioinformatische Analysen und in vitro Untersuchungen der biosynthetischen Maschinerie konnte der Mirubactin Gencluster identifiziert werden. Es konnte eine Biosyntheseroute postuliert werden, welche die iterative Verwendung eines an eine Thiolierungsdomäne gebundenen Substrats (MrbD), sowie die Bildung eines ungewöhnlichen O-Acylhydroxamsäureesters durch eine C-terminale Kondensationsdomäne (MrbJ), enthält. Zusätzlich wurden zwei Templat-unabhnägige CDPS-Biosynthesewege untersucht, die für die Synthese der Nocazine und die Generierung von modifizierten Ditryptophan-Diketopiperazinen (DKPs) zuständig sind. Mittels bioinformatischer Analysen konnte der erste Nocazine-Gencluster identifiziert werden. Durch in vivo und in vitro Studien konnte die gesamte Biosyntheseroute von Nocazine E und XR334 aufgeklärt werden. Die DKP-Bildung wird durch die CDPS Ndas_1148 katalysiert, welche ein neues Produktprofil aufweist bei dem cyclo(L-Phe-L-Tyr) und cyclo(L-Phe-L-Phe) die beiden Hauptprodukte darstellen. Weitere Modifikation des DKP-Gerüsts wird anschließend durch kombinatorischen Gebrauch einer Cyclodipeptidoxidase (Ndas_1146/1147) sowie zweier SAM-abhängiger O-/N-Methyltransferasen (Ndas_1145 und Ndas_1149) erreicht. Ein CDPS-Gencluster, zuständig für die Biosynthese von methylierten Ditryptophan-DKPs, konnte durch Genomanalyse von A. mirum identifiziert werden. Der Biosyntheseweg wurde durch in vivo und in vitro Untersuchungen aufgeklärt. Zu Beginn katalysiert die hoch spezifische CDPS Amir_4627 die Bildung des vormals unbekannten CDPS-Produkts cyclo(L-Trp-L-Trp). Nun methyliert die SAM-abhängige N-Methyltransferase Amir_4628 entweder einen oder beide Ring-Stickstoffe des DKP-Gerüsts und bildet somit die einfach- oder doppelt-methylierten Ditryptophan-DKP Produkte.