Role and visualization of the single-stranded and double-stranded DNA in the biofilm of Neisseria gonorrhoeae

Neisseria gonorrhoeae, der Erreger der sexualübertragenden Erkrankung Gonorrhoe, ist ein gram-negatives menschen-adaptiertes Diplococcus. 80% der klinischen Isolate enthalten durch den horizontalen Gentransfer erworbene Gonoccale Genetische Insel (GGI), welche ein ungewöhnliches Type-Vier-Secretionssystem (T4SS) kodiert. In manchen Stämmen von N. gonorrhoeae ist Einzelstrang-DNA-Bindendes Protein (SSB) nicht nur auf dem Chromosom kodiert, es gibt ein zweites SSB, SsbB, welches innerhalb der GGI kodiert ist. SSB sind hoch konservierte, essentielle Proteine, die in allen Domänen des Lebens vertreten sind. Diese Proteinklasse bindet mit sehr niedriger Sequenzspezifität und gleichzeitig mit sehr hoher Affinität an die Einzelstrang-DNA (ssDNA), außerdem sind sie bei der DNA-Rekombination, Replikation und Reparatur unerlässlich. Die zweite Kopie von SSB kann entweder auf einem Chromosom oder einem Plasmid kodiert sein. Diese SSBs sind bei diversen Mechanismen wie natürliche Kompetenz, Plasmidtrennung und DNA Transport, tätig. Wir haben die physiologische Rolle von SsbB Protein analysiert, sowie seine Funktionen biochemisch charakterisiert. Wir stellten fest, dass die nähesten Homologe von SsbB innerhalb konservierter genetischer Kluster auf den genetischen Inseln verschiedener Proteobacteria lokalisiert sind. Diese Kluster kodieren DNA Prozessierungs Enzyme wie ParA und ParB, Partitionierungsproteine, TopB, Topoisomerase und vier konservierte hypothetische Proteine. Die in diesen Klustern gefundene SsbB Homologe bilden eine separate/gesonderte von den anderen Familie der einzelstrang DNA Binde Proteine. Wir konnten demonstrieren, dass im Gegensatz zu den meisten anderen SSBs, SsbB kann nicht Escherichia coli ssb Deletionsmutante komplementieren. Aufgereinigtes SsbB bildete ein stabiles Tetramer. Elektrophoretische Mobilitäts Gel-Shift Assay, Fluoreszenztitrationsassay und die Raster-Kraft Mikroskopie demonstrierten, dass SsbB mit hoher Affinität an die ssDNA bindet. Ein SsbB-Tetramer braucht minimum 15 nucleotide, Zwei SsbB-Tetramere brauchen 70 Nukleotide, um an die ssDNA zu binden. Der Bindungsmotif war von Mg2+ oder NaCl Konzentration unabhängig. Wir konnten keine Rolle von SsbB weder für die DNA Sekretion noch für die DNA Aufnahme zeigen, jedoch wir konnten demonstrieren, dass SsbB die Aktivität der Topoisomerase I stimuliert. Wir vermuten, dass SsbB eine noch unbekannte Rolle für die Erhaltung der genetischen Inseln spielt. Bemerkenswerterweise wurde für die T4SS von N. gonorrhoeae Secretion von ssDNA gebunden an die Relaxase direkt ins Medium gezeigt. Derzeit ist fast nichts über die exakte Funktion der sekretierten DNA bekannt. Studien haben gezeigt, dass nicht nur die Exopolysaccharide aber auch die extrazellulare DNA (eDNA) eine wichtige Rolle für die anfängliche Etablierung von Biofilmen spielen kann. Die Zusammensetzung und der Ursprung der eDNA sind nicht komplett erforscht. Die Biofilme von N. gonorrhoeae enthalten große Mengen der eDNA, welche eine wichtige Rolle für die Biofilmbildung spielt. Um die Rolle der ssDNA für die Biofilmbildung zu untersuchen, wurde der Verlauf der Biofilmbildung von N. gonorrhoeae Stamm MS11 mit dem MS11ΔTraB Stamm, welcher in Secretion von ssDNA beeinträgtigt ist, und dem komlementierten Stamm MS11 ΔtraB::traB, wo die Secretion wieder hergestellt ist, verglichen. Des Weiteren wurde die Rolle der ssDNA für die Biofilmbildung durch die Behandlung der Biofilme mit der Exonuklease I, welche spezifisch nur ssDNA degradiert, untersucht. Diese Experimente demonstrierten, dass die secretierte ssDNA stark die Biofilmbildung stimuliert, vor allem aber in der Phase der anfänglichen Anhaftung. Darüber hinaus haben wir eine einzigartige Methode entwickelt, um die ssDNA and dsDNA separat zu detektieren. Für die Visualisierung der ssDNA, wurden SSB Proteine, welche mit sehr niedriger Sequenzspezifität und gleichzeitig mit sehr hoher Affinität an die ssDNA binden, eingesetzt. Das hochstabile SSB Protein aus Thermoanaerobacter tengcongensis sowie verschiedene Cysteine-Mutanten in diesem Protein wurden isoliert. Die verschiedenen Cystein-enthaltene Proteine wurden mit umweltempfindlichen Fluoreszenzproben markiert. Die spezifischen Kombinationen von Cystein- Mutanten und Fluoreszenzproben wurden getestet, um solche Kombinationen zu erhalten, bei denen eine Zunahme der Fluoreszenz nach der Bindung des Proteins stattfindet. Für die Detektion der dsDNA wurde das thermostabile dopple-strang DNA bindendes Protein Sac7d aus Sulfolobus acidocadarius verwendet. Beide Proteine wurden für die Visualisierung von ssDNA und dsDNA in den Biofilmen sowie planktonischen Kulturen verwendet. Bemerkenswerterweise, konnte mit dieser Methode nur dsDNA in den Biofilmen von N. gonorrhoeae detektiert werden. Wir schlussfolgern, dass ssDNA eine wichtige Rolle für die Biofilmbildung spielt, jedoch sind die Mengen der ssDNA in den Biofilmen viel geringer als der dsDNA.