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Konstruktion synthetischer Stoffwechselwege zur Produktion von(R)-Benzylsuccinat und weiteren aromatischen Metaboliten
In dieser Arbeit wurden „synthetische“ anaerobe Bakterien konstruiert, die über Veränderungen ihrer Gärungswege neuartige Fermentationsprodukte herstellen. In einem ersten Schritt wurde ein Synthese-Modul für die Produktion von Benzoyl-CoA als biosynthetisches Startermolekül in Escherichia colientwi...
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| 格式: | Dissertation |
| 语言: | 德语 |
| 出版: |
Philipps-Universität Marburg
2013
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| 总结: | In dieser Arbeit wurden „synthetische“ anaerobe Bakterien konstruiert, die über Veränderungen ihrer Gärungswege neuartige Fermentationsprodukte herstellen. In einem ersten Schritt wurde ein Synthese-Modul für die Produktion von Benzoyl-CoA als biosynthetisches Startermolekül in Escherichia colientwickelt, das aus einem Benzoattransporter (kodiert durch benKaus dem Benzoat-abbauenden Bakterium Aromatoleum aromaticum) und einer Benzoat-CoA Ligase (kodiert durch bclA aus A. aromaticum) besteht. In dieser Arbeit wurde dieses Synthese-Modul zur Entwicklung von Stoffwechselwegen zur (R)-Benzylsuccinat-Synthese oder zur Synthese pflanzlicher Biphenyle in Bakterien eingesetzt. Das Synthese-Modul kann darüber hinaus zur Biosynthese vieler weiterer interessanter Naturstoffe eingesetzt werden, bei denen Benzoyl-CoA als Baustein benötig wird.
i) Die aromatische Dicarbonsäure Benzylsuccinat ist ein Intermediat des anaeroben Toluolabbaus mit potentiellen biotechnologischen Anwendungen, z.B. zur Synthese von Bio-Polymeren. Für die biologische Produktion von Benzylsuccinat wurde ein zweites biosynthetisches Modul generiert, das aus den Genenfür sieben Enzyme aus Geobacter metallireducensbesteht, die am anaeroben Toluol-Abbau beteiligt sind. Diese Enzyme katalysieren normalerweise den Abbau des ersten Intermediats Benzylsuccinat zu Benzoyl-CoA und Succinat über eine modifizierte β-Oxidation. Durch gleichzeitige Expression beider Biosynthese-Module in E. coliund durch Zufütterung von Benzoat war es tatsächlich möglich, durch das Umkehren der β-Oxidation Benzylsuccinat in signifikanten Mengen zu produzieren. Die Ausbeute wurde ca. 1000-fach gesteigert durch anaerobe Anzucht unter Gärungs- und Fumaratatmungsbedingungen (von ca. 3 nM auf bisher max. 5 µM). Dies belegt, dass die Projektidee zur Schaffung „synthetischer Anaerobier“ tatsächlich funktioniert. Außerdem wurde gezeigt, dass die zusätzliche Expression eines Gens für ein unspezifisches Exportkanal-Protein die Ausbeute an produziertem Benzylsuccinat um den Faktor 3,5 steigern kann. Dieses
System kann nun über weitere genetische Veränderungen in Verbindung mit Modell-rechnungen auf gesteigerte Produktivität bis hin zueiner möglichen industriellen Anwendung optimiert werden.
ii) Für die Synthese des pflanzlichen Sekundärmetaboliten 3,5-Dihydroxybiphenyl wurden zusätzlich zum „Benzoyl-CoA-Modul“ Gene für die entsprechende Biphenyl-Synthase aus
der Vogelbeere (lat. Sorbus aucuparia) sowie für eine Malonyl-CoA Synthetase aus Paracoccus denitrificansin die Wirtsorganismen E. coliund Shimwellia blattae eingeführt. Die Malonyl-CoA Synthetase diente hierbei zur besseren Versorgung mit dem zweiten notwendigen Biosynthesebaustein Malonyl-CoA. Obwohl alle Enzyme in ausreichender Aktivität produziert wurden, wurde hier bisher noch keine Biphenyl-Produktion beobachtet. Stattdessen produzierten diekonstruierten Zellen große Mengen an Indol, das in Enterobakterien als Stress-Metabolit bekannt ist. Neben Indol wurden in
den rekombinanten Zellen auch einige unbekannte Verbindungen detektiert. Eine dieser Verbindungen beinhaltet Malonat als Synthesebaustein. Weitere Untersuchungen sind daher nötig, um die Identität dieser Malonat-abhängigen Verbindung aufzuklären und um zu zeigen, in welchem Zusammenhang diese Substanz mit dem synthetischen Biphenyl-Stoffwechselweg steht. |
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| DOI: | 10.17192/z2013.0339 |