The role of Stp1, a secreted effector, in the biotrophic interaction of Ustilago maydis and its host plant maize

Bei der Etablierung der biotrophen Interaktion zwischen Ustilago maydis und Mais spielen sekretierte Effektoren eine entscheidende Rolle. In einer vorausgegangenen Studie(Schipper, 2009) konnte gezeigt werden, dass die Deletion des stp1 Effektor-Gens zu einem vollständigen Verlust der Virulenz führt und dass entsprechende Mutanten eine hypersensitive Reaktion auslösen. Diesbezüglich unterscheidet sich stp1 von den meisten anderen untersuchten Effektoren, die entweder keinen oder nur einen geringen Beitrag zur Virulenz des Pilzes leisten. Diese vorliegende Arbeit befasst sich mit der funktionellen Analyse von Stp1. Mutationsanalysen zeigten, dass die konservierten N- und C-terminalen Domänen von Stp1 zwar als separate Polypeptide exprimiert werden können, aber die Gegenwart beider Domänen nötig ist, um die Stp1 Funktion zu komplementieren. Es wurde nachgewiesen, dass die zentrale variable Domäne von Stp1 keine essentielle Funktion übernimmt, allerdings könnte diese Domäne für die Proliferation des Pilzes entlang der Leitbündel eine Rolle spielen. stp1 Homologe aus mit U. maydis nahe verwandten Brandpilzen waren in der Lage, die Funktion von stp1 in U. maydis zu komplementieren, was für eine konservierte Funktion spricht. Eine Stp1 Version, bei der die zentrale Domäne deletiert wurde (Stp1Δ136-432), konnte bis zur Homogenität aufgereinigt werden und erwiess sich als stabil, während die isolierte C-terminale Domäne, Stp1433-515, nach der Aufreinigung instabil war. Diese Beobachtung könnte darauf hinweisen, dass sich die N- und C-terminalen Domänen von Stp1 gegenseitig stabilisieren. Durch Immunlokalisierung konnte ein Stp1-HA Fusionsprotein im Zellkern von Pflanzenzellen detektiert werden, die mit dem Stamm SG200stp1-HA infiziert waren. Demzufolge könnte Stp1 auf die Transkription von Genen Einfluss nehmen und dadurch die pflanzliche Abwehrreaktion unterdrücken. In einem Hefe-zwei-Hybrid-System, bei dem Stp1 als Köder benutzt wurde, konnten sowohl apoplastische als auch cytoplasmatische Mais Proteine als Stp1-Interaktoren identifiziert werden. Dies könnte bedeuten, dass Stp1 ein Effektorprotein mit dualer Funktion zum einen im Apoplasten und zum anderen im pflanzlichen Zytoplasma ist. Sowohl die gereinigte C-terminale als auch die N-terminale Domäne von Stp1war in der Lage, die Aktivität der extrazellulären Mais Cystein-Protease Sip3 zu inhibieren, die zuvorals ein apoplastischer Interaktionspartner von Stp1 identifiziert werden konnte. Die Interaktion zwischen Stp1 und den cytoplasmatischen Interaktoren Sip9 (cell number regulator 8), Sip16(CCR4-NOT Transkriptionskomplex Untereinheit), Sip19(Serine/Threonin- Kinase) und demVIP2 Protein Sip21 konnten nach Expression der jeweiligen Gene in voller Länge verifiziert werden, müssen aber zukünftig noch durch weitere Methoden bestätigt werden. RNA-Seq Analysen des Transkriptoms infizierter Mais Blätter zeigten, dass einige der frühen pflanzlichen Abwehrgene, die nach Infektion mit einem stp1-Deletions Stamm induziert werden, Hingegen führte die Infektion mit einem stp1-Deletions Stamm komplementiert durch den Stp1 C-Terminus sogar zu einer stärkeren Abwehrreaktion als sie nach Infektion mit dem stp1- Deletionsstamm beobachtet wurde. Dies weist darauf hin, dass die N- und C-terminale Domänen von Stp1 unterschiedliche Funktionen erfüllen könnten.