lin-Benzopurines as Inhibitors of tRNA-Guanine Transglycosylase: Perturbance of Homodimer Formation, Import of Water Clusters and Determinants of Crystallographical Disorder

Im Rahmen dieser Dissertation wurden Inhibitoren der TGT unter verschiedenen Gesichtspunkten entwickelt und untersucht. Hierbei kamen zahlreiche Methoden des strukturbasierten Wirkstoffdesign zum Einsatz. Die TGT-Dimerstabilität in Lösung und deren Beeinflussbarkeit durch Liganden wurde untersucht (Kapitel 2). Erstmals konnte eine ligandinduzierte Destabilisierung des Homodimers in Lösung nachgewiesen werden, welche auf die nadelartig in die interface-Region reichenden Ligandseitenketten zurückgeführt werden konnte. Die detaillierte Analyse von drei TGT-Ligand-Komplexstrukturen, komplementiert mit entsprechenden Affinitätsdaten, konnte den Einfluss der angesteuerten Helix-loop-Substruktur auf die Dimerstabilität offenlegen. War diese aufgrund vorausgegangener Mutationsstudien noch als entscheidend für den Zusammenhalt der assemblierten TGT-Monomere eingeschätzt worden, ist das Strukturelement, trotz seiner Beteiligung an zahlreichen kristallographisch konservierten Wechselwirkungen zum korrespondierenden Monomer, von nur geringer Bedeutung für die Dimerstabilität. Die sich ergebende Widersprüchlichkeit zwischen der ligandinduzierten Dimerdestabilisierung in Lösung und der offensichtlich geringen Bedeutung der Helix-loop-assoziierten gerichteten Wechselwirkungen konnte durch molecular modelling und Molekulardynamik-Simulationen aufgeklärt werden. Die kristallstrukturbasierten Simulationen zeigten, dass die beschriebene loop-Struktur - auch in Gegenwart eines gebundenen, nadelartig dekorierten Liganden - einer hydrophoben Kontaktfläche zwischen beiden Monomeren deckelartig aufliegt. Eine hydrophobe Triade bestehend aus drei aromatischen Resten ist an der Bildung dieser Kontaktfläche beteiligt und konnte aufgrund ihrer Konservierung in allen untersuchten Ligandkomplexen als wahrscheinliche hot spot-Interaktion des Dimer interface ausgemacht werden. In Kapitel 3 wurden zwei Serien von TGT Inhibitoren entwickelt und untersucht. Jede Serie basiert auf einer Variation des in vorangegangenen Arbeiten entwickelten lin-Benzoguanin-Grundgerüsts. Die lin-Benzohypoxanthine, bei denen die exozyklische Aminofunktion an C(6) des Trizyklus entfernt wurde, und die C(6)-N-alkylierten lin-Benzoguanine wurden hinsichtlich Membranpermeabilität, pKa-Profil, Bindungsmodus in Kristallstrukturen und Bindungsaffinität charakterisiert. Die festgestellten Eigenschaften wurden mit den analogen lin-Benzoguaninen verglichen. Für die Pyrimidin-Partialstruktur der lin-Benzohypoxanthine konnte eine Verschiebung von zwei pKa-Einheiten zu erhöhter Azidität gegenüber den analogen lin-Benzoguaninen erzielt werden. Trotz verminderter Protonierbarkeit der lin-Benzohypoxanthine konnte aber keine verbesserte Membranpermeabilität erreicht werden. Sehr wahrscheinlich wird ein günstigeres biopharmazeutisches Profil durch die in allen untersuchten Verbindungen erhaltene, leicht protonierbare 2-Aminoimidazol-Partialstruktur verhindert. Ein Wassernetzwerk konnte als ein mit der Bindung von lin-Benzohypoxanthinen assoziiertes, kristallographisch konserviertes Arrangement dargestellt werden. Das teilweise auch in der apo-Struktur sichtbare Netzwerk bildet günstige Wechselwirkungen sowohl zu gebundenen lin-Benzohypoxanthinen als auch zu Resten der Bindetasche aus. Obgleich das Netzwerk den Affinitätsverlust gegenüber den lin-Benzoguaninen nicht kompensieren kann, konnte anhand der Komplexstrukturen zweier C(6)-N-alkylierter lin-Benzoguanine der potentiell große Einfluss günstiger Protein-Wasser- und Ligand-Wasser-Interaktionen auf die Bindungs-affinität gezeigt werden. In Kapitel 4 wurde eine Serie disubstituierter lin-Benzoguanine und lin-Benzohypoxanthine im Hinblick auf den kristallographischen Bindungsmodus und die Bindungsaffinität charakterisiert. Die Kombination zweier Substituenten am trizyklischen Grundgerüst ermöglicht die zeitgleiche Bindung der Liganden in der Ribose33- und Ribose34-Tasche. Hierdurch konnte erstmals eine pikomolare Bindungsaffinität für einen TGT-Inhibitor erreicht werden. Der Vergleich der beschriebenen disubstituierten Verbindungen mit ihren monosubstituierten Analoga machte jedoch deutlich, dass sich die Beiträge der einzelnen Substituenten zur Bindungsaffinität nicht zwingend additiv verhalten. Weiterhin konnte in Kapitel 4 erstmals ein kristallographisch geordneter Bindungsmodus für die C(2)-Seitenketten dreier Liganden in der Ribose33-Tasche festgestellt werden. Auffällig ist hierbei die Ummantelung der apolaren Seitenketten durch kristallographisch definierte Wassernetzwerke, welche die geordneten Konformationen vermutlich stabilisieren. Ein signifikanter Einfluss des geordneteren Bindungsmodus auf die Bindungsaffinität der entsprechenden Liganden ist hingegen nicht festzustellen. Kapitel 5 beschreibt eine TGT-Variante, in deren Bindetasche ein Aspartat mittels positionsgerichteter Mutagenese durch ein Asparagin ersetzt wurde.