Biochemical and molecular analyses of the biosynthesis pathway of the indole derivatives in Piriformospora indica

Der mutualistische Wurzelendophyt Piriformospora indica besitzt die Fähigkeit eine Vielzahl unterschiedlicher Pflanzen, einschließlich der monokotylen Gerste (Hordeum vulgare) und der dikotylen Modelpflanze Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana), zu besiedeln. Die Besiedelung sowohl von Ackerschmalwand als auch von Gerste ist durch eine Besiedlungsstrategie charakterisiert, welche sich in zwei Phasen unterteilt: einer initialen, biotrophen Interaktion und einer, sich daran anschließenden, Zelltot- assoziierten Phase. Im Verlauf beider Phasen können Pilzhyphen inter- und intrazellulär beobachtet werden. Das Pilzwachstum beschränkt sich hierbei jedoch auf die Cortexzellen der Wurzel, eine Besiedelung von Endodermis oder Zentralzylinder konnte nie beobachtet werden. Die Besiedlung der Wurzelzellen durch P. indica ist dabei oft mit vorteilhaften Effekten für den Wirt assoziiert, wie zum Beispiel Wachstumsförderung und Änderungen der Wurzelmorphologie. Das breite Wirtsspektrum und die positiven Effekte für den Wirt lassen auf eine generelle Interaktionsstrategie schließen, bei der Proteine des Pilzes mit pflanzlichen Signalwegen interagieren, die in vielen verschiedenen Pflanzenarten vorkommen. Ein solcher Mechanismus könnte der Eingriff von P. indica in die Phytohormonbiosynthese sein. Hierzu konnte kürzlich gezeigt werden, dass Phytohormone neben ihrer Rolle als Regulatoren von Entwicklungsprozessen in Pflanzen auch an der Pflanzenabwehr beteiligt sind. Des weiteren wurde bereits die Sekretion von Indol-3-Essigsäure (IAA) in das Wachstumsmedium durch P. indica beschrieben. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde die Produktion von IAA aus Tryptophan in P. indica durch eine Reihe biochemischer und molekularer Methoden charakterisiert. Die Hauptziele lagen dabei auf einer funktionellen Untersuchungen der IAA Biosynthese in P. indica und welche Auswirkung diese auf die Kompatibilität während der biotrophen Interaktion von P. indica mit Gerstenwurzeln haben. Hierfür wurden geeignete molekulare Methoden für den Gebrauch in P. indica etabliert und optimiert. Zu diesen gehören eine PEG-vermittelte genetische Transformation, sowie ein GFP-Reporter- und ein RNA-Interferenz (RNAi) System. Mittels zeitabhängiger Analyse der Transkriptionsrate nach Zugabe von Tryptophan, konnte das Tryptophan-Aminotransferase Gen piTam1 als Kandidat für die Beteiligung an der IAA-Produktion in P. indica identifiziert werden. Die Untersuchung des piTam1 Promoters durch ein GFP-Reporter System sowie transkriptionelle Analysen des Genes in besiedelten Gerstenwurzeln, verifizierten die Aktivierung der piTam1 Expression während der biotrophen Phase. Durch Suppression dieser Expression mittels RNA-Interferenz (RNAi) wurde piTam1 als Schlüsselgen in der Umwandlung von Tryptophan in Indol-3-Pyruvat (IPA) identifiziert, welches den ersten Schritt in der Produktion von Auxin aus Tryptophan darstellt. RNAi Transformanden, deren Auxin-Produktion gehemmt war, zeigten ein weniger kompaktes Koloniewachstum und unterschieden sich in ihrer Fähigkeit Indol-3-Acetaldehyd (IAD) umzusetzen. Zusätzlich führte die gehemmte IAA-Biosynthese zu einer verminderten Besiedlung von Gerstenwurzeln durch P. indica während der ersten drei Tage der Interaktion, wobei jedoch die wachstumsfördernden Effekte nicht beeinflusst wurden. Konsequent, ein erhöhter Gehalt an freiem IAA und Indol-3-Lactat (ILA) einem Nebenprodukt der IAA Biosynthese in P. indica, konnten in besiedelten Wurzeln im Vergleich zu Kontrollwurzeln beobachtet werden. Obwohl 3 Tage nach Inokulation mit P. indica eine erhöhte IAA Konzentration in planta gemessen wurde, ist es unwahrscheinlich, dass die beobachteten Unterschiede lediglich durch pilzliches IAA verursacht wurden. Dies lässt eine Akkumulation von pilzlichen und pflanzlichen IAA vermuten und stimmt mit den Änderungen der IAA Signalübertragung und der Biosynthese im Gerste-Transkriptom zu diesem Zeitpunkt überein.