Biodegradable amphiphilic PEG-PCL-PEI triblock copolymers designed for the self-assembly of multifunctional gene carriers

Im Gegensatz zu einer symptomatischen Behandlung schwerwiegender Erkrankungen ermöglicht die Gentherapie einen kausalen Therapieansatz durch direkte Manipulation genetischen Materials. Eines der vielversprechendsten Trägersysteme zur Realisierung dieser Zielsetzung setzt sich aus amphiphilen Blockcopolymeren zusammen. Gegenstand der vorliegenden Dissertation ist die Etablierung eines multifunktionalen PEG-PCL-PEI Blockcopolymer-Trägersystems für die Gentherapie. Hierfür erforderte das an der Schnittstelle unterschiedlichster wissenschaftlicher Disziplinen angesiedelte Thema fächerübergreifendes Arbeiten, um den chemischen, physikochemischen, pharmazeutischen und biomedizinischen Aspekten der Aufgabenstellung in vollem Umfang gerecht zu werden: Der erste Schritt umfasste den Aufbau einer Vektorbibliothek aus PEG-PCL-PEI Blockcopolymeren. Das Verhältnis aus hydrophilen und hydrophoben Kettensegmenten wurde hierbei systematisch variiert. Anschließend wurden die Blockcopoylmere zu Trägern verarbeitet und deren Aufbau wurde mittels nicht-invasiver Methoden charakterisiert. Hierbei wurde beobachtet, dass sich überwiegend hydrophile Polymere zu kleineren, mizellartigen Trägern formierten, während eher hydrophobe Ketten zu größeren, partikelartigen Vektoren aggregierten. Die Erforschung eines Zusammenhangs zwischen Polymerzusammensetzung und den Eigenschaften der Träger (Kolloidstabilität und Toxizität) ermöglichte die selektive Auswahl repräsentativer Polymere einer jeden Vektorklasse. Zweitens: Der Prozess der Selbstorganisation von Polymeren zu Trägern und deren Beladung mit Nucleinsäuren wurde erforscht und optimiert. Im Rahmen dieser Arbeiten war das Ziel die Grundzüge des elektrostatischen Ladungsprozesses besser zu verstehen und mit Hilfe dieser Erkenntnisse kompakte Nanokomplexe zu generieren. Dieses Kapitel basiert auf der Hypothese, dass ein gleichmäßigerer Komplexierungsvorgang zu einer homogeneren Verteilung von Ladungen und folglich zu Trägerkomplexen mit verbesserten Eigenschaften führen sollte. Folglich kristallisierte sich eine microfluidale Herstellungstechnik, bei der Träger und RNA während des gesamten Herstellungsprozesses gleichmäßig zusammengeführt werden, als die am besten geeignete Beladungsmethode heraus. Durch diese Technik wurden Komplexe mit verbesserter Kolloidstabilität, RNA-Einbettung und letztendlich auch Transfektionseffizienz erzielt. Die Prozessparameter wurden anschließend im Rahmen eines statistischen Designs im Detail untersucht. Drittens: Die Überführung von Nanoträgern in eine lagerstabile, trockene Form, stellt eine der Grundvoraussetzungen für die effektive Nutzung in vivo dar. Im Zuge der Untersuchungen wurden frisch hergestellte Trägersuspensionen unter Zugabe des Lyoprotektors Glucose gefriergetrocknet. Bereits durch geringe Glucosekonzentrationen konnten die Eigenschaften unbeladener Träger nach Rehydrierung wiederhergestellt werden. Bei anschließender Beladung mit siRNA wurde im Vergleich zu frischen Trägern kein Unterschied bezüglich der Komplexgröße, der Größenverteilung oder der Transfektionseffizienz detektiert. Darüber hinaus gelingt die Trocknung bereits beladener Trägerkomplexe bei erhöhten N/P-Verhältnissen sowie höheren Glucosekonzentrationen. Viertens: Die vielversprechendsten Träger sollten nun auf ihre Transfektionsaktivität hin untersucht werden. In guter Übereinstimmung der Ergebnisse in vitro und in vivo wurde bei hydrophoben Trägern eine hohe Transfektionseffizienz ermittelt, wohingegen bei hydrophilen Vektoren kaum Aktivität detektiert wurde. Die Ergebnisse der FACS-Analyse zeigten, dass die geringe Aktivität hydrophiler Vektoren durch mangelnde zelluläre Wechselwirkung, höchstwahrscheinlich bedingt durch eine dickere PEG-Hülle, verursacht wird. Im Zuge dieser Arbeiten wurde folglich eine Verbindung ausgewählt, welche sich durch gute Transfektionseffizienz bei gleichzeitig geringerer Toxizität (im Vergleich zu PEI-Homopolymeren) auszeichnet. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen des Lungengewebes untersuchter Mäuse zeigten vorrangig Emission im Alveolargewebe. Dieses Ergebnis prädestiniert das etablierte Trägersystem für eine zukünftige Anwendung zur lokalen Therapie von Lungenerkrankungen. Schließlich wurde die Möglichkeit einer doppelten Fluoreszenzmarkierung von Trägerkomplexen untersucht. Durch Beladung des hydrophoben PCL-Kerns mit Quantenpunkten gefolgt von der Komplexierung mit fluoreszenzmarkierter siRNA wurde ein FRET-Paar etabliert, welches sich hervorragend zur Detektion der Komplexintegrität eignet. Die auf diese Weise doppelt markierten Träger zeichneten sich durch Emission von Licht der Wellenlänge des Akzeptors bei Anregung des Donors aus. Sie lieferten damit den Beweis für den Energietransfer im intakten FRET-Komplex. Es wurde folglich ein multifunktionales und biologisch aktives Vektorsystem geschaffen, welches sich hervorragend für theragnostische Zwecke oder für eine simultane Verabreichung von Nucleinsäuren und Wirkstoffen eignet. Der FRET-induzierte Schalteffekt ermöglicht eine Echtzeituntersuchung von Komplexstabilität und Entladevorgang. Ein Durchbrechen des Zusammenhangs zwischen Ladung, Aktivität und Toxizität ist die wohl wichtigste Herausforderung zukünftiger Arbeiten. Dies könnte durch eine Erhöhung der Selektivität des Trägersystems im Zuge der Einführung von geeigneten Rezeptoren gelingen. Hydrophile Träger mit dicker PEG-Hülle, erhöhter Kolloidstabilität und geringer Toxizität wären die idealen Kandidaten für eine derartige Modifikation. Das Langzeitziel bei der Erforschung nicht-viraler Vektoren ist klar: Die Effektivität von Vektoren muss gesteigert, die Toxizität verringert werden. Durch rationales Vektordesign, welches wiederum systematische und intensive Grundlagenforschung bedingt, ist zu erhoffen, dass zukünftig sichere und effektive Trägersysteme zur kausalen Therapie gegenwärtig als unheilbar klassifizierter Krankheiten entwickelt werden können.