Microchip HPLC: Experimental investigation of separation efficiency, column characteristics, and coupling with mass spectrometry

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit verschiedenen Aspekten, welche die chromatographische Effizienz in der miniaturisierten HPLC beeinflussen. Der Einfluss der Kanalgeometrie auf die chromatographische Effizienz von gepackten Mikrochipkanälen wurde untersucht. Es wurden HPLC/UV Mikrochips mit Trennkanälen von quadratischem, trapezoidalen und gaußförmigen Querschnitt eingesetzt. Die Mikrochips wurden Laserablation und Lamination der Polyimidfolien hergestellt. Als Packungsmaterialien wurden 3 oder 5 µm-große sphärische C8-Kieselgelpartikel verwendet und unter optimierten Bedingungen in den Trennkanal gepackt. Die Dispersionseigenschaften der ungepackten Trennkanäle wurden vermessen und mit berechneten Daten der axialen Dispersionseigenschaften von Zylindern verglichen. Packungsdichten und Bodenhöhen der verschiedenen gepackten Betten werden miteinander verglichen und deren Unterschiede erklärt. Die Packungen der 3 µm Partikel reflektieren das Dispersionsverhalten der Leerkanäle. Die Dispersion in den 5 µm Packungen korreliert mit den erhaltenen Packungsdichten, die wiederum durch die Anzahl und die Erreichbarkeit der Ecken in den jeweiligen Kanalquerschnitten limitiert sind. Interpartikuläre Porositäten und Zwischenkornvolumina von gepackten Kapillarsäulen und kommerziell erhältlichen analytischen Umkehrphasensäulen wurden mittels intrapartikulärem Donnan-Ausschluss einer kleinen, nicht-retardierten und ko-ionischen Verbindung (Nitrationen) bestimmt. Die Anwendbarkeit der Methode wurde für Kieselgel, Umkehrphasen- und Kationenaustauschermaterialien mit unterschiedlichen Partikelgrößen, Porendurchmessern und Partikelkonstruktion (vollporös und core-shell) in Abhängigkeit der Ionenstärke der mobilen Phase untersucht. Die Nitrationen werden bei niedrigen Pufferkonzentrationen vollständig von dem intrapartikulären Porenraum der Partikel ausgeschlossen, deutlich sichtbar durch eine Plateauregion, in welche die Elutionsvolumina der Nitrationen laufen. Für die kommerziellen HPLC-Säulen wurden deutliche Plateauregionen beobachtet, sogar im Falle von sehr dicht gepackten core-shell und 1,8 µm Partikeln. Dies zeigt, dass die Donnan-Ausschlussmethode sehr gut geeignet ist, die interpartikulären Porositäten schnell und einfach bis auf die dritte Nachkommastelle zu bestimmen. Die erhaltenen interpartikulären Porositäten stimmen mit den Werten der inversen Größenausschlussmethode gut überein. Einschränkungen in der Anwendbarkeit treten erst auf, wenn der Donnan-Ausschluss (elektrostatischer Ausschluss) oder der mechanische Ausschluss der inversen Größenausschlusschromatographie auch im Zwischenkornraum der gepackten Betten auftreten. Dies ist der Fall für sehr kleine, hochgeladene Partikel oder sehr großen Porendurchmessern. Graduelle Änderungen in der Zusammensetzung der mobilen Phase während einer Gradientenelution beeinflusst die Elektrosprayionisation bei direkter Kopplung mit einem Massenspektrometer. Der Einfluss der Eluentzusammensetzung auf den Elektrospraymodus und die damit einhergehenden Änderungen der Spraystabilität und des MS-Signals werden mittels Infusions- und Injektionsexperimenten untersucht. Die verwendete HPLC/ESI-MS Konfiguration bestand aus einem Mikrochip mit Anreicherungssäule, Trennkanal und Make-up Flusskanal. Eine Nanopumpe wurde an den Trennkanal angeschlossen, eine zweite bediente den Make-up Flusskanal mit einem inversen Lösungmittelgradienten. Die beiden Lösungsmittelströme wurden vor der Elektrosprayspitze zusammengeführt, so dass an der Elektrosprayspitze eine identische Eluentzusammensetzung über den gesamten Gradientenlauf vorlag. Signalparameter eines Analyten wurden mit und ohne Kompensation über den Make-up Fluss aufgezeichnet und mit der Spraystabilität und dem jeweiligen Elektrospraymodus korreliert. Die Anwendung des post-column Make-up Flusses verbesserte die Spray- und Signalstabilität erheblich, ohne die chromatographische Effizienz zu beeinträchtigen.