Analysis of the Host Stress Response to Ebola Virus Infection and Generation of a Recombinant Marburg Virus Expressing EGFP to Study Viral Spread

Die hoch pathogenen Filoviren Ebola- (EBOV) und Marburg-Virus (MARV) sind Erreger eines hämorrhagisches Fiebers mit Lethalitätsraten von bis zu 90%. Bislang sind weder spezifische antivirale Medikamente noch eine Impfung für den Einsatz am Menschen verfügbar. Die hohe Sterblichkeitsrate sowie die fehlende Therapie und Prophylaxe bedingen, dass Filoviren als Erreger der höchsten biologischen Sicherheitsstufe (4) klassifiziert werden und somit eine Erforschung nur in Hochsicherheitslaboratorien erlaubt ist. Herstellung eines rekombinanten Marburg-Virus mit Fluoreszenzmarker Ziel dieses Projekts war die Herstellung eines rekombinanten MARV, welches das „enhanced green fluorescence protein“ (EGFP)-Gen von einer zusätzlichen, in das virale Genom eingefügten Transkriptionseinheit exprimiert. Viren, die fluoreszierende Proteine exprimieren, erleichtern die Untersuchung des viralen Vermehrungszyklus und sind wertvolle Hilfsmittel für das „Screenen“ von potentiellen antiviralen Medikamenten. Das EGFP-Gen wurde zwischen dem zweiten Gen des MARV-Genoms, dem VP35-Gen, und dem nachfolgenden VP40-Gen eingefügt. Das rekombinante Virus (rMARV-EGFP) wurde über ein cDNA-Zwischenprodukt in transfizierten Zellen generiert und anschliessend in „live-cell imaging“ Versuchen eingesetzt. Eine Expression von EGFP wurde 32 Stunden nach Infektion erstmals detektiert und eine Infektion von Nachbarzellen nach 55 Stunden. Im Vergleich zum rekombinanten Wildtyp-MARV wurde ein eingeschränktes virales Wachstum festgestellt. Dies ist wahrscheinlich auf die Insertion einer zusätzlichen Trankriptionseinheit zurückzuführen, da Gene, die hinter dem eingefügten EGFP-Gen liegen, weniger stark exprimiert wurden. In filoviralen Infektionen können charakteristische virale Einschlusskörper (inclusion bodies) detektiert werden, die sich im Zytoplasma infizierter Zelle bilden. Initiiert wird die Bildung dieser Einchlusskörper durch die Akkumulation des viralen Nukleoproteins (NP). Immunfluoreszenzanalysen von Zellen, die mit rMARV-EGFP infiziert waren, zeigten eine Akkumulation des EGFP in viralen Einschlusskörpern. In Tansfektionsexperimenten wurde die Relokalisierung verschiedener Fluoreszenzproteine in filovirale Einschlusskörper untersucht. Dies zeigte, dass ektopisch exprimierte Fluoreszenzproteine sowohl mit MARV- als auch mit EBOV-spezifischen Einschlusskörpern colokalisierten. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass die Expression von NP in der Abwesenheit anderer viraler Proteine ausreichend für die Akkumulation von EGFP in den Einschlusskörpern ist. Im Gegensatz dazu akkumulierten ektopisch exprimierte GFP-Fusionsproteine, die ein zelluläres Lokalisierungssignal besitzen, nicht in MARV-spezifischen Einschlusskörpern. Dies lässt darauf schließen, dass ektopisch exprimierte Proteine unspezifisch in den viralen Einschlusskörpern akkumulieren, wenn sie kein Lokalisierungssignal besitzen. Durch Immunfluoreszenzanalysen konnte zudem gezeigt werden, dass die EGFP-Aggregate zwar durch die Autofluoreszenz detektiert werden konnten, aber nicht in der Antikörperfärbung sichtbar waren. Dies weist darauf hin, dass Antikörper nicht in der Lage sind, virale Einschlusskörper zu durchdringen. Die zelluläre Stressantwort in Ebola-Virus Infektion Ebola-Viren sind in der Lage, essentielle antivirale Signalwege der Interferon-induzierten Immunantwort zu hemmen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Interaktion von EBOV mit einem weiteren antiviralen Abwehrmechanismus, der zellulären Stressantwort, untersucht. Exogen induzierter Stress kann zur Aktivierung vier verschiedener Kinasen führen, die in aktivierter Form die α-Untereinheit des eukaryotischen Initiationsfaktors 2 (eIF2) phosphorylieren. Dies wiederum führt zu einer Hemmung der Proteinsynthese, welche mit der Bildung von cytoplasmatischen „stress granules“(SG) und „processing bodies“ (PB) einhergeht. Viren, die auf den zellulären Proteinsyntheseapparat angewiesen sind, haben vielseitige Abwehrstrategien gegen die zelluläre Stressantwort entwickelt. Im Folgenden wurde untersucht, wie EBOV mit SG und PB interagiert. Aufgrund der dynamischen Struktur von SG und PB wurden vorwiegend mikroskopische Analysen durchgeführt. Zunächst wurde untersucht, ob filovirale Infektionen eine Stressantwort induzieren. Es konnte gezeigt werden, dass in EBOV-infizierten Zellen keine endogenen SG gebildet werden. Die Behandlung von EBOV-infizierten Zellen mit dem Stressinduktor Natriumarsenit (As) führte zur Bildung von SG, allerdings in einer geringeren Anzahl von infizierten Zellen, verglichen mit nicht infizierten, behandelten Zellen. Die Ergebnisse weisen auf eine Hemmung von SG in mit EBOV infizierten Zellen hin. Zur besseren Visualisierung von SG wurde für die weiteren Untersuchungen eine Zelllinie verwendet, die das SG-Markerprotein „ras-GAP SH3 domain binding protein 1“ (G3BP) konstitutiv exprimiert. In mit EBOV infizierten, G3BP-exprimierenden Zellen wurden SG mit zwei verschiedenen Toxinen induziert, As und Hippuristanol (Hip). Während As die Phosphorylierung von eIF2α induziert, bewirkt Hip die Hemmung der eIF4A-abhängigen Translationsinitiation, ein Prozess, der unabhängig von der Phosphorylierung von eIF2α zu der Bildung von SG führt. SG-Bildung wurde durch beide Toxine in mit EBOV infizierten Zellen ausgelöst, eine Reduktion wurde allerdings nur für die Bildung von As-induzierten SG in mit EBOV infizierten Zellen beobachtet. Interessanterweise wurden zudem SG-ähnliche G3BP-EGFP-Aggregate in den viralen Einschlusskörpern beobachtet, die sowohl in behandelten als auch in nicht behandelten EBOV-infizierten Zellen auftraten. Es konnte weiterhin durch Transfektionsversuche gezeigt werden, dass die Bildung viraler Einschlusskörper, die durch die Expression von Nukleokapsidproteinen induziert wurde, nicht ausreichend war, um die Aggregation von G3BP-EGFP in den viralen Einschlusskörpern zu bewirken. Dies lässt darauf schließen, dass andere Faktoren, wie beispielsweise virale RNA, benötigt werden, um SG-Komponenten in die viralen Einschlusskörper zu rekrutieren. Diese Ergebnisse weisen auf eine Hemmung der zellulären Stressantwort durch EBOV hin, die auf der Inhibition der Bildung von SG und auf einer Sequestierung essentieller SG-Komponenten beruht. Zur weiteren Charakterisierung der Inhibition von SG durch EBOV wurden in Transfektionsversuchen die RNA-bindenden EBOV Proteine NP, VP30 und VP35 einzeln exprimiert. Während VP30 mit SG kolokalisierte ohne diese zu beeinträchtigen, wurde für das dsRNA-bindende VP35 eine inhibierende Wirkung auf die Bildung von SG beobachtet. In Zellen, die VP30 oder VP35 gemeinsam mit NP exprimierten, wurden beide Proteine in die von NP induzierten Einschlusskörper rekrutiert, und die Kolokalisation mit SG war entweder stark reduziert oder nicht vorhanden. Dies wurde auch in mit EBOV infizierten Zellen beobachtet. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass VP30 und VP35 nur in ungebundener Form mit SG interagieren. Die Menge an freien VP30- und VP35-Proteinen in EBOV-infizierten Zellen ist wahrscheinlich zu gering, um in der Immunfluoreszenzanalyse detektiert zu werden. Unter As-induzierten Stressbedingungen wird die „dsRNA dependent protein kinase“ (PKR) von dem zellulären Protein „PKR activating protein“ (PACT) aktiviert. Aktivierte PKR phosphoryliert eIF2α, was zur Bildung von SG führt. Die Aktivierung von PKR durch dsRNA wird von dem EBOV-Protein VP35 effizient inhibiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die As-induzierte Aktivierung von PKR nicht von EBOV inhibiert werden kann. Fabrozzi et al. (2011) konnten bereits eine Bindung zwischen VP35 und PACT in nicht gestressten Zellen nachweisen. In dieser Arbeit wurde diese Bindung durch Coimmunpräzipitationsanalysen bestätigt und zudem gezeigt, dass in mit As behandelten Zellen VP35 nicht in der Lage ist an PACT zu binden. Dies könnte eine Bindung von PACT an PKR ermöglichen und damit zu der beobachteten Aktivierung von PKR führen. Die Aktivierung von PKR in mit EBOV infizierten Zellen nach As-Behandlung könnte auch die Bildung von SG in diesen Zellen erklären. Aus der beobachteten Reduktion von As-induzierten SG in EBOV-infizierten Zellen wird geschlossen, dass VP35 SG-Komponenten inhibiert oder relokalisiert. Dies scheint mit der Expressionsrate von VP35 zusammenzuhängen. Zur weiteren Charakterisierung der zellularen Stressantwort wurde die Rolle von PB in EBOV infizierten Zellen näher untersucht. Hierzu wurde eine Zelllinie verwendet, die das PB-Markerprotein „mRNA-decapping enzyme 1A” (DCP1a) exprimiert. Eine Rekrutierung von As-induzierten PB an die viralen Einschlusskörper, die aber nicht zu einer Kolokalisation führte, konnte in EBOV infizierten Zellen beobachtet werden. Diese wurde auf die von NP initiierte Bildung von Einschlusskörpern zurueckgefuehrt. Expressionsstudien zeigten, dass PB mit VP35 kolokalisierten, aber nicht mit VP30 oder NP. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass in Zellen, in denen es zu einer durch VP35 bedingten Hemmung der SG-Bildung kam, die entstandenen, diffusen G3BP-EGFP-Aggregate nicht nur mit VP35 kolokalisierten, sondern auch mit PB interagierten. Dies weist darauf hin, dass VP35 mit SG- und PB-Komponenten interagiert und diese verbindet. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass EBOV Mechanismen zur Kontrolle der antiviralen zellulären Stressantwort entwickelt hat, in denen VP35 eine wichtige Rolle spielt, da es mit Komponenten von SG und PB interagiert. Des Weiteren scheint die Bindung zwischen VP35 und PACT eine wichtige Rolle in der Kontrolle von PKR zu spielen.