Identification and Characterization of the Lysobactin Biosynthetic GeneCluster and Its Unusual Termination Module

Nichtribosomale Peptide (NRP) konstituieren eine Klasse strukturell und funktionell diverser Naturstoffe, welche durch nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) synthetisiert werden. Nichtribosomale Peptide weisen eine Vielfalt biologischer Aktivitäten auf, sowie antimikrobielle, antifungielle, antivirale, immunsuppressive und antitumore Eigenschaften. Durch Screening mikrobieller Extrakte wurden zahlreiche solcher Verbindungen entdeckt. In den letzten Jahren ermöglichten die Kenntnisse über die Biosynthese von Naturstoffen und die Entwicklung der Sequenzierungstechnologien Identifikation von Genclustern, die vermutlich an der Biosynthese von nichtribosomalen Peptiden beteiligt sind. Basierend auf der Sequenzierung des Genoms von Lysobacter sp. ATCC 53042 und der früheren Arbeit von Bernhard et al.[1] an dem Gen-Fragment, das an der Biosynthese von Lysobactin beteiligt ist, wurde der gesamte Gencluster der Lysobactinbiosynthese identifiziert und charakterisiert. Der Gencluster kodiert zwei multimodulare nichtribosomale Peptidsynthetasen (LybA und LybB). Wegen der Korrelation zwischen der Anzahl der Module innerhalb des Genclusters und der primären Struktur von Lysobactin wurde festgelegt, dass die Biosynthese von Lysobactin dem Kolinearität-Prinzip folgt. Die Untersuchung der Spezifitäten der Adenylierungsdomäne bestätigte den direkten Zusammenhang zwischen den Synthetasen und der Biosynthese von Lysobactin. Darüber hinaus wurde eine ungewöhnliche Tandemthioesterase-Architektur im Terminationsmodul von LybB identifiziert. Die biochemische Charakterisierung der einzelnen Thioesterasen in vitro bewies, dass die erste Thioesterase für die Zyklisierung und Freisetzung des Endproduktes zuständig ist, während die zweite Thioesterase eine Typ II TE Aktivität zeigte, die für die Regeneration des Peptide-Carrier-Proteins verantwortlich ist. Zusammen mit der Beobachtung des proteolytischen Abbaus, der während der heterologen Produktion von LybB-PCP-TE1-TE2 die Produktion von LybB-PCP-TE1 verursacht, haben wir vorgeschlagen, dass die LybB auch im nativen Stamm gespalten wird. Somit wird die dadurch erzeugte allein stehende TE2 produziert, die als externer Typ II TE dient. Zusätzlich wurde die Sequenz des Genoms von Lysobacter sp. ATCC 53042 bioinformatisch analysiert. Die Analyse lieferte weitere potenzielle NRPS und PKS-NRPS Hybridgencluster. Basierend auf den vorhergesagten Spezifitäten der Adenylierungsdomänen wurden Strukturvorschläge für die putativen Produkte gemacht. Es sind jedoch weitere Untersuchungen nötig, um die Produktion dieser putativen sekundären Metaboliten zu bestätigen und um die vorgeschlagenen Strukturen zu verifizieren.