Towards an understanding of peroxisome dynamics in mammalian cells

Peroxisomen sind ubiquitäre Zellorganellen, die an einer Vielzahl wichtiger metabolischer Prozesse beteiligt sind. Viele dieser Funktionen werden in enger Kooperation mit Mitochondrien ausgeführt. Da Peroxisomen für die Gesundheit und Entwicklung des Menschen essentiell sind, führen peroxisomale Dysfunktionen zu schwerwiegenden Erkrankungen. Des Weiteren sind Peroxisomen sehr dynamische Zellorganellen, die ihre Proteinkomposition, Morphologie und Anzahl an die zellulären Anforderungen anpassen. Kürzlich wurde ein Patient mit einem letalen Defekt der mitochondrialen und peroxisomalen Teilung identifiziert; daraus wird ersichtlich, dass der korrekte Ablauf dynamischer peroxisomaler Prozesse eng mit der Funktion der Organelle verknüpft ist und somit ebenfalls essentiell für die menschliche Gesundheit ist. Die Dynamik der Peroxisomen als solche wird durch Wachstums- und Teilungsprozesse reguliert, jedoch können Peroxisomen unter bestimmten Bedingungen auch de novo aus dem ER gebildet werden. In Säugerzellen geht der peroxisomale Wachstums- und Teilungsprozess mit einer Reihe klarer morphologischer Veränderungen der Organelle einher: eine initiale Elongation der peroxisomalen Membran wird durch das peroxisomale Membranprotein Pex11pβ, während die Durchschnürung der peroxisomalen Tubuli in kleinere Organellen durch die Membranadaptoren Mff, Fis1 sowie die GTPase DLP1 erfolgt. Interessanterweise sind letztere Proteine auch an der Teilung von Mitochondrien beteiligt. Die Frage, ob ausgereifte Peroxisomen ähnlich wie Mitochondrien, miteinander fusionieren, blieb umstritten. Es wurden außerdem diverse externe Stimuli identifiziert, die die Dynamik der Peroxisomen verändern, jedoch sind die Mechanismen ihrer Rezeption und der Signaltransduktion auf die Ebene der Organelle weithin unbekannt. Die vorliegende Studie zielte daher darauf ab, Einblicke in Prozesse zu gewinnen, die an der Dynamik der Peroxisomen als solche beteiligt sind und zu ihrer Regulation beitragen. Diese Dissertation besteht aus drei Teilen: im ersten Teil wurde die Existenz einer Fusion ausgereifter Peroxisomen, analog zur mitochondrialen Fusion, untersucht. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Regulation von Pex11pβ, des Schlüsselproteins der peroxisomalen Biogenese in Säugerzellen, durch post-translationale Mechanismen untersucht, um Einblicke in die Regulation der peroxisomalen Dynamik auf der Ebene der Organelle selbst zu gewinnen. Im dritten Teil dieser Studie wurden verschiedene Gruppen von Stimuli im Hinblick auf ihren Effekt auf das peroxisomale Kompartiment charakterisiert, um die Regulation der peroxisomalen Dynamik auf transkriptioneller Ebene in Säugerzellkulturmodellen zu untersuchen. Um die Fusion ausgereifter Peroxisomen in Säugerzellen zu untersuchen, wurde ein in vivo Fusionsassay in CHO-Säugerzellen etabliert. Dieser beruhte auf der Kokultivierung stabiler Zelllinien, die GFP- oder DsRed-basierte peroxisomale Matrix- oder Membranmarker exprimierten, und der anschließenden Generierung von Hybridomzellen durch Zellfusion. Eine Überlappung der unterschiedlichen peroxisomalen Marker wurde fluoreszenzmikroskopisch in nach verschiedenen Zeitpunkten fixierten Zellen festgestellt, was zunächst auf einen gewissen Grad peroxisomaler Fusionen hinwies. Weitere Studien in lebenden Zellen zeigten jedoch, dass kein Austausch peroxisomaler Marker stattfand. Allerdings wurde erstmals die Existenz transienter peroxisomaler Interaktionen charakterisiert. Interagierende Peroxisomen gingen dabei enge Kontakte ein, die für die beobachtete Überlappung von peroxisomalen Markern in fixierten Zellen verantwortlich waren. Computer-basiertes Modelling und mathematische Analyse ergab, dass transiente peroxisomale Interaktionen einem komplexen, nicht-zufälligen Verhaltensmuster folgten, welches potentiell zu einer Homogenisierung des peroxisomalen Kompartiments beitragen könnte. Vorstimulation der Zellen mit peroxisomalen Substraten wies darauf hin, dass Fettsäuren und H2O2 nicht ausgetauscht wurden, jedoch könnten transiente peroxisomale Interaktionen dem Austausch anderer peroxisomaler Metabolite dienen oder Teil eines Signalsystems z. B. zur Feststellung der Verteilung der Peroxisomenpopulation sein. Erstmals konnte außerdem erklärt werden, warum nur ein bestimmter Anteil von Peroxisomen (15 %) Mikrotubuliabhängig bewegt wird. Zusätzlich wurde erstmals nachgewiesen, dass mitochondriale Fusionsproteine nicht peroxisomal lokalisiert sind, welches daraufhin weist, dass die Dynamik der Peroxisomen durch andere, charakteristische Prozesse reguliert wird. Um die Regulationsmechanismen der peroxisomalen Dynamik an der Organelle selbst zu untersuchen, wurde das zentrale Membranprotein Pex11pβ biochemisch charakterisiert. Differentielle Permeabilisierung und protease-protection assays ermöglichten in Kombination mit einem seit kurzem erhältlichen Antikörper die Lokalisation der ersten Transmembrandomäne von Pex11pβ zwischen den Aminosäurepositionen 90 und 110. Im Anschluss wurde die Bedeutung der N-terminalen Domäne von Pex11pβ für die Regulation der Proteinaktivität untersucht: die Deletion der ersten 40 Aminosäuren des Proteins inhibierte bereits die Pex11pβ-induzierte Elongation peroxisomaler Membranen, obwohl die für die Membrandeformation essentielle amphipathische Helix intakt blieb. Nach unterschiedlichen Expressionszeitpunkten wurde chemisches Cross-linking und eine Anreicherung von Pex11pβ durchgeführt, was darauf hinwies, dass eine Homodimerisierung für die Proteinaktivität vonnöten ist. Diese wiederum war abhängig von der N-terminalen Domäne von Pex11pβ. Im Gegensatz zum orthologen Protein in S. cerevisiae, wiesen In vivo phospho-labelling- Experimente nicht auf eine Phosphorylierung von Pex11pβ in Säugerzellen hin. Daher scheinen die Pex11 Proteine im Säuger- und Hefesystem gegensätzlich reguliert zu werden. Eine Überexpresssion von Pex11pβ in Peroxisomen-defizienten Patientenfibroblasten führte des weiteren zu einer Fehllokalisation des Proteins an Mitochondrien, wo es eine exzessive mitochondriale Fragmentierung verursachte. Diese Beobachtung unterstreicht, dass in Säugerzellen Mitochondrien anstatt des ER als alternatives Membrankompartiment für peroxisomale Proteine dienen, wenn keine peroxisomalen Membranen vorhanden sind. Daraus resultierende Effekte auf die Dynamik und Funktion der Mitochondrien könnten zum klinischen Phänotyp peroxisomaler Erkrankungen beitragen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurden externe Stimuli charakterisiert, die die peroxisomale Dynamik beeinflussen, um ein eher physiologisches Säugerzellkulturmodel zu etablieren, welches Untersuchungen zur Regulation dynamischer peroxisomaler Prozesse ermöglicht. Die Behandlung von SH-S5Y5 Neuroblastomzellen mit dem Neurotoxin 6-OHDA hatte keinen Einfluss auf die peroxisomale Dynamik, resultierte allerdings in einer prominenten DLP1-abhängigen Fragmentierung der Mitochondrien. Obwohl DLP1 von beiden Organellen geteilt wird, werden demnach mitochondriale und peroxisomale Dynamik unterschiedlich voneinander reguliert. Des weiteren wurde eine Reihe verschiedener Komponenten, die zytosolischen und mitochondrialen oxidativen Stress auslösen, appliziert, diese führten allerdings nicht zu einer Veränderung des peroxisomalen Kompartiments in Säugerzellen. KillerRed-basierte Induktion von oxidativem Stress in verschiedenen Kompartimenten führte zu ähnlichen Resultaten in lebenden Zellen. Dies weist darauf hin, dass andere Faktoren als oxidativer Stress allein, wie z. B. der extra- oder intrazelluläre Ursprung des Signals, eine Veränderung des zellulären Redox-Gleichgewichts oder andere, bisher unidentifizierte Signaltransduktionsmechanismen, dazu beitragen, eine Veränderung der peroxisomalen Dynamik, wie in früheren Studien beobachtet, auszulösen. Die Behandlung von AR42J Zellen, einer Rattenzelllinie pankreatischen Ursprungs, mit dem synthetischen Glukokortikoid Dexamethason führte zu einer prominenten, kontinuierlichen Elongation von Peroxisomen. Interessanterweise wurde die tubuläre Morphologie der Peroxisomen aufrechterhalten, selbst wenn der externe Stimulus entfernt wurde. Die kontinuierliche peroxisomale Tubulation könnte mit der Zelldifferenzierung verknüpft sein oder auf eine bestimmte metabolische Funktion hinweisen. Dexamethasonbehandlung führte außerdem zu einer transkriptionellen Induktion von Pex11β (and Pex11α) durch einen potentiell PPARα-unabhängigen Mechanismus. Daher hat das hier etablierte Modell der Dexamethason-induzierten peroxisomalen Elongation großes Potenzial, als eher physiologisches Säugerzellkulturmodell zur Untersuchung der Regulation von peroxisomaler Dynamik zu dienen. Weitere Studien wurden bereits initiiert, um Veränderungen des peroxisomalen Expressionsprofil nach Dexamethason-Stimulation zu untersuchen. Diese deinen dazu, neue Komponenten und/oder molekulare Mechanismen aufzuklären, die Dynamik von Peroxisomen regulieren.