Gene expression in Phycomyces blakesleeanus after light and gravity stimulation

Licht zählt zu den wichtigsten abiotischen Faktoren. Es steuert eine Vielzahl von Schlüsselprozessen der pilzlichen Biologie und des Lebenszyklus. Der filamentöse Pilz Phycomyces blakesleeanus ist seit mehr als 50 Jahren ein Modellorganismus der sensorischen Physiologie. Eine lineare Signaltransduktionskette vom Lichtrezeptor zu den Effektoren wurde bisher postuliert. Durch die Isolierung und Charakterisierung von Verhaltensmutanten (mad), aber besonders durch die Identifizierung der Gruppe der wc-Fotorezeptorgenen (madA, madB) konnten große Fortschritte in der molekularen Photophysiologie erzielt werden. Das Pendant der White Collar-1/-2 Fotorezeptoren/Transkriptionsfaktoren in N. crassa sind in P. blakesleeanus die MADA- und MADB-Proteine, welche einen photosensitiven Transkriptionsfaktor-Komplex (MAD-Komplex) bilden, um multiple lichtkontrollierte Prozesse der pilzlichen Genese zu steuern (Sanz et al., 2009). In dieser Arbeit wurden, aus fünf differenten funktionellen Proteingruppen wie den WC-Typ Fotorezeptoren, Hitzeschock-Proteinen, RNA-/Chromatik-Modulierenden Enzymen, Zytoskelettkomponenten und Enzyme der ß-Karotinbiosynthese, 25 Gene verwendet, um die Rolle der WC-Typ Fotorezeptoren in der fotoregulierten Genexpression näher zu untersuchen. Dazu wurde ein Protokoll entwickelt, in dem eine nicht saturierte transkriptionelle Änderung nach einem Puls von aktinischem Licht, mittels der qRT-PCR-Methode gemessen, determiniert wurde. Dabei stand nicht nur die blaulichtabhängige Transkriptionsänderung des Wildtyps und der mad-Mutanten im Vordergrund, sondern vor allem die Erforschung der Genexpression nach Rotlicht- und gravitropischer Stimulation. Die Genexpression von in Dunkelheit gewachsenen Myzelien des Wildtyps von P. blakesleeanus wurde über einen Zeitraum von 11,5 Stunden gemessen. Sie zeigt differente transkriptionelle Niveaus der Gene. Diese korrelieren nicht mit ihren funktionellen Gruppen, was eine spezifische Genregulation postulieren lässt. In den mad-Mutanten ist die Transkription von mehr als der Hälfte der Gene verschieden von derjenigen des Wildtyps, was die Hypothese einer genspezifischen Regulation und die Wichtigkeit des photosensitiven Transkriptionskomplexes MAD untermauert. Im Gegensatz zu N. crassa konnte keine endogene Genexpressionsrhythmik nachgewiesen werden. Im Wildtypstamm von P. blakesleeanus ist nach einem Blaulichtpuls oder konstanterer Blaulichtbestrahlung die Transkription der meisten Gene (60 %) verändert. Dabei wurden hauptsächlich Expressionsaktivierungen, aber auch Inhibitionen festgestellt. Konstante Blaulichtbestrahlung führt bei 11 Genen zu einer moderaten, (3 bis 20-fachen), und bei 15 Genen zu einer starken (20 bis 80-fachen) transkriptionellen Induktion im Wildtyp. Diese unterschiedlichen Expressions- aktivierungen korrelieren nicht mit den funktionellen Gengruppen, was eine individuelle Genregulation vermuten lässt. Dabei gilt als empirische Regel, dass die Gene, mit dem geringsten Expressionsniveau in Dunkelheit, nach Blaulicht den höchsten Anstieg ihrer mRNA zeigen. In keinem der einfachen mad-Mutanten konnte nach einem Blaulichtpuls eine komplette Expressionsinhibition gemessen werden, vielmehr wurden stark vom Wildtyp abweichende Transkriptionsniveaus festgestellt. Nur in den Doppel-madAB- und Triple-madABC-Mutanten blieb eine Photo- aktivierung aus. Dies demonstriert die dominante Rolle des MAD-Komplexes einerseits und lässt einen komplexeren Regulationsmechanismus andererseits vermuten. Zusätzlich zu den transkriptionellen Blaulichteffekten wurde die Genexpression nach Rotlichtbestrahlung erforscht. Rotlicht moduliert die Transkription sowohl positiv als auch negativ. Einige Gene zeigen photoreversible Expressionsänderungen nach einem Rotlichtpuls oder nach konstanterer Rotlicht- bestrahlung. Die zeitabhängigen transkriptionellen Rotlichteffekte sind im Wildtyp abweichend von denen nach Blaulichtbestrahlung, wobei einige sogar gegenteilige Änderungen zeigen. Mutationen an den WC-Typ Fotorezeptorgenen führen nach Rotlichtbestrahlung bei einigen Genen zu einer stärkeren Inhibition der Genexpression als der entsprechenden Aktivierung nach Blaulicht im Wildtyp. Diese Ergebnisse verdeutlichen einmal mehr die Komplexität der Genregulation in P. blakesleeanus, welche die Beteiligung von mehr als nur den madAB Fotorezeptoren nahe legt. Die Expressionsänderungen nach bichromatischer Bestrahlung unterstreichen die Vermutung, dass weitere Fotorezeptoren in der transkriptionellen Regulation involviert sind. Gravitropische Stimulation führt bei einigen Genen im Wildtyp zu einer transienten Expressionsänderung, welche sich von der in den mad-Mutanten deutlich unterscheidet. Diese Ergebnisse unterstreichen die zentrale Rolle des MAD- Komplexes für die Genregulation nicht nur bei der Integration des Lichtsignals, sondern auch bei der des Schwerereizes, und deuten auf weitere regulatorische Elemente hin. Ein Genregulationskomplex-Modell mit genspezifischen regulatorischen Elementen und anderen Fotorezeptoren wird diskutiert.