Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide mediates differential signaling through PAC1 receptor splice variants and activates non-canonical cAMP dependent gene induction in the nervous system - Implications for homeostatic stress-responding

Aktivierung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors PAC1 durch PACAP resultiert in Aktivierung von Gs und Gq und führt über Second Messenger-Produktion zur Aktivierung von Gentranskription, die essentiell für die homöostatische Stressantwort zu sein scheint. Durch differenzielles Splicing der dritten intrazellulären Schleife von PAC1 entstehen sogenannte PAC1null-, hop- und hip-Rezeptoren. In non-neuralen Zellen beeinflusst die Expression verschiedener Rezeptor-Varianten die Second Messenger-Generation. Als Kotransmitter an der splanchnico-adrenomedullären Synapse ist PACAP für anhaltende Katecholamin-Freisetzung von chromaffinen Zellen unentbehrlich, welche zur Wiederherstellung der Homöostase während anhaltendem Stress dient. Im zentralen Nervensystem ist PACAP neuroprotektiv in Assoziation mit z.B. Schlaganfall. In der vorliegenden Arbeit wurde die Produktion von Second Messengern durch verschiedene PAC1-Splice-Varianten und die Aktivierung homöostatischer Antworten in neuroendokrinen und neuralen Zellen untersucht. Heterologe Expression von PAC1hop, der Haupt-Variante chromaffiner Zellen, in PC12 Zellen, resultierte in einer PACAP-evozierten Ca2+- und anhaltenden sekretorischen Antwort, ähnlich der in primären chromaffinen Zellen. Auch die Aktivierung von PAC1null, jedoch nicht von PAC1hip, vermittelte eine intrazelluläre Ca2+-Antwort; diese war etwas geringer als die durch PAC1hop vermittelte. Weder PAC1null- noch PAC1hip-Aktivierung resultierte in anhaltender Katecholamin-Freisetzung. Dies zeigt die Notwendigkeit der Expression der hop-Kassette für anhaltende Freisetzung von Katecholaminen aus neuroendokrinen Zellen. Heterologe Expression von PAC1hop, null und hip in NG108-15 Zellen resultierte in PACAP-aktivierter cAMP-Produktion, während eine intrazelluläre Ca2+-Antwort nur durch PAC1hop und etwas geringer durch PAC1null vermittelt wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Signalkopplung an Ca2+ durch Expression der hop-Kassette erhöht und durch Expression der hip-Kassette aufgehoben wird; eine effiziente duale Signaltransduktion durch cAMP und Ca2+ wird also nur durch die PAC1hop-Variante vermittelt. Diese resultierte in einer Aktivierung der MAP Kinasen ERK1/2. Zyklisches AMP, jedoch nicht die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) waren in die Aktivierung von ERK involviert. PACAP induzierte das putativ neuroprotektive Gen Stanniocalcin 1 (STC1), welches laut Literaturstand neuronale Resistenz bei ischämischem Insult vermittelt; die Genaktivierung erfolgte via ERK, unabhängig von PKA. Direkte Stimulation von Adenylatzyklasen durch Forskolin hingegen löste keine ERK-Aktivierung aus und STC1-Induktion wurde durch kanonische (PKA-abhängige) Signaltransduktion vermittelt. In NG108-15 Zellen scheinen also zur Aktivierung von nicht-kanonischer cAMP-abhängiger Signaltransduktion, welche ERK-abhängige Geninduktion vermittelt, zusätzlich PAC1hop-aktivierte Ca2+-Signalwege nötig zu sein. Primäre kortikale Neuronen exprimierten hauptsächlich die PAC1hop- und PAC1null-Varianten. PACAP-Behandlung resultierte in einer intrazellulären Erhöhung von cAMP und Ca2+, ERK-Aktivierung und STC1-Induktion. Die ERK-Aktivierung war cAMP-abhängig und PKA-unabhängig. STC1-Induktion wurde durch ERK und nicht durch PKA vermittelt. Forskolin-Behandlung resultierte ebenso in PKA-unabhängiger ERK-Aktivierung sowie STC1-Induktion. Dies zeigt, dass in differenzierten kortikalen Neuronen gesteigerte cAMP-Produktion zur ERK-Aktivierung ausreicht. PACAP-vermittelte BDNF-Geninduktion hingegen war PKA-abhängig. Im Tiermodell konnte gezeigt werden, dass PACAP im Zusammenhang mit Schlaganfall neuroprotektiv ist. Um erste Einsichten in den Mechanismus dieser Neuroprotektion zu bekommen, wurden zwei Zellkultur-Modelle für Schlaganfall angewandt. Sauerstoff-Glukose-Deprivation und Glutamat-induzierte Excitotoxizität lösten, wie erwartet, in kortikaler Neuronenkultur Zelltod aus, der sich jedoch als PACAP-resistent herausstellte. Auch durch STC1-Überexpression konnte der durch Excitotoxizität ausgelöste Zelltod nicht reduziert werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die neuroprotektiven Effekte von PACAP und STC1 während neurodegenerativen Erkrankungen durch Zellen vermittelt werden, die in kortikaler Neuronenkultur fehlten, wie z.B. Gliazellen. Insgesamt weisen die Befunde dieser Arbeit darauf hin, dass die Expression verschiedener PAC1-Varianten den Aktivierungsgrad zweier Second Messengers bedingt und damit den funktionellen Ausgang nach Stress-Einwirkung bestimmt. PACAP-vermittelte ERK-Aktivierung und STC1-Induktion via nicht kanonischer cAMP-abhängiger Signaltransduktion unterscheidet sich von der kanonischen PKA-vermittelten Signaltransduktion, welche in physiologischen Prozessen wie Gedächtniskonsolidierung von Bedeutung ist. Die selektive pharmakologische Aktivierung dieses potenziell neuroprotektiven nicht-kanonischen Signalweges hat therapeutische Implikation für Neuroprotektion in vivo.