Sepsis Proteome Analysis by the Combination of Immunodepletion, Two-dimensional HPLC and nanoLC-MS/MS

Sepsis ist eine infektionsinduzierte Inflammationsreaktion des Körpers, wobei die Intensität des infektiösen Triggers nicht mit der Intensität der Antwortreaktion des Wirtsorganismus kongruent sein muss. Während eine kontrollierte lokal be-schränkte inflammatorische Reaktion der Elimination der Infektion dient, kann sie unkontrolliert systemisch zu einer Vielzahl von Ereignissen führen, die letztendlich im Multiorganversagen enden kann. Pathogenetisch bedeutsam ist hierbei die aus der Dysfunktion des unspezifischen Immunsystems resultierende Gerinnungsaktivierung und endotheliale Dysfunktion. Die frühe Erkennung der Sepsis und die Vorhersage der Mortalität sind zwingend notwendig für eine weitere Senkung der immer noch hohen Sepsissterblichkeit weltweit. Die bisherigen Sepsismarker sind für diese Aufgabe nur unzureichend geeignet. In der vorliegenden Arbeit sollte mit Hilfe eines neuen Flüssigkeitschromatografie- basierten Verfahrens zur differenziellen Proteomanalyse versucht werden, Biomarkerkandidaten aus Plasmaproben von Sepsispatienten zu identifizieren. Dabei wurde das Proteinreinigungssystem ProteomeLab IgY-12 zur Abtrennung der 12 High-Abundance-Plasmaproteine eingesetzt. Anschließend erfolgte mit dem Proteinseparationssystem Proteome Lab PF2D eine zweidimensionale Auftrennung der Proteine nach isoelektrischem Punkt und Hydrophobizität. Die integrierte DeltaVue Software zeigt die Unterschiede zwischen normalen und septischen Proteomen an. Die differenziell dargestellten Peaks wurden, fraktioniert gesammelt, zur weiteren Identifizierung potentieller Biomarker anhand von nano LC-MS/MS analysiert. Nach verschiedenen Optimierungsschritten zeigte sich die angewandte „IgY-PF2D-nanoLC-MS/MS“ – Strategie als effektive und effiziente Methode zur differentiellen Proteomanalyse humaner Plasmaproben. In der vorliegenden Studie wurden Plasmaproben von gesunden Probanden und Patienten mit Sepsis untersucht. Von den 124 Patienten mit Sepsis, schwerer Sepsis und septischen Schock wurden Plasmaproben von 5 männlichen Patien¬ten mit ähnlicher Krankengeschichte und Sepsisursache für die differenzielle Proteomanalyse verwendet. Als Referenzproteom wurden Plasmaproben von 5 gesunden männlichen Probanden (altersgematcht) herangezogen. Insgesamt wurden 1800 Fraktionen analysiert und 233 einzelne Proteine identifiziert. 17 Proteine, die nur in den Patientenproben mit Sepsis vorkamen, wurden als Biomarkerkandidaten postuliert. Neben bekannten Akute – Phase – Proteinen wurden auch einige neue Proteine wie z. B. Lumican, Urinary Protease Inhibitor und Cationic trypsinogen als putative Sepsismarker identifiziert, deren Rolle in der Sepsispathogenese noch zu klären sind. Alle 17 Biomarkerkandidaten sollten nun in weiteren gezielten Studien hinsichtlich ihres diagnostischen und prognostischen Wertes überprüft werden.