Biogenesis of peroxisomes in mammalian cells: Characterization of the Pex11 proteins and their role in peroxisomal growth and division

Peroxisomes are multifunctional organelles involved in various metabolic processes. Peroxisomal malfunctions lead to numerous mostly severe disorders, rendering perox-isomes essential for human health and development. Peroxisomal abundance can be adjusted to the cellular needs, since peroxisomes hav...

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Main Author: Delille, Hannah Katharina
Contributors: Jacob, Ralf (Prof. Dr. ) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2011
Subjects:
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Table of Contents: Peroxisomen sind multifunktionale Zellorganellen, die in eine Vielzahl von metaboli-schen Prozessen involviert sind. Peroxisomale Dysfunktionen führen zu verschiedensten zum Teil schwerwiegenden Erkrankungen. Peroxisomen sind für die Entwicklung und Gesundheit des Menschen essentiell. Die Anzahl der Peroxisomen kann den jeweiligen Anforderungen durch Proliferation oder Degradation der Organellen angepasst werden. Peroxisomen vermehren sich durch Wachstum und Teilung, sie können aber auch de novo aus dem Endoplasmatischen Retikulum gebildet werden. Der Wachstums- und Teilungsprozess besteht aus mehreren Schritten: Elongation, Segmentierung und anschließende Durchschnürung der peroxisomalen Tubuli. Die genauen Mechanismen und molekularen Komponenten der Wachstums- und Teilungsmaschinerie sind noch weitestgehend unbekannt. Die ersten identifizierten Säugerproteine sind Pex11pβ, hFis1 und DLP1. Pex11pβ vermittelt die peroxisomale Elongation, während hFis1 der Membranandapter für DLP1 ist, welches wiederum die Organellen teilt. Interessanterweise sind hFis1 und DLP1 gleichermaßen an der Teilung der Mitochondrien beteiligt. Ziel dieser Arbeit war es nun die molekularen Mechanismen der peroxisomalen Proliferation und Teilung weiter aufzuklären. Zunächst wurde das duale Targeting von hFis1, einem C-terminal verankerten Protein, untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Pex19p, ein peroxisomaler Importfaktor, an hFis1 bindet und das peroxisomale Targeting von hFis1 vermittelt. Pex19p wird hinge-gen nicht für den mitochondrialen Import benötigt. Die Binderegion von Pex19p konnte auf die C-terminalen 26 Aminosäuren eingegrenzt werden. Des Weiteren wurde gezeigt, dass basische Aminosäuren im C-Terminus von hFis1 zwar für den mitochondrialen Import von Nöten sind, der peroxisomale Import und die Bindung von Pex19p erforderte diese Aminosäuren hingegen nicht. Weitere Regulations-mechanismen scheinen zu existieren, da das peroxisomale Targeting von hFis1 nicht mittels Überexpression von Pex19p gesteigert werden konnte. Die erzielten Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass das Targeting von hFis1 zu Peroxisomen und Mitochondrien zwei unabhängige Prozesse sind. Zudem scheinen C-terminal verankerte Proteine direkt und Pex19p-abhängig in die peroxisomale Membran inseriert zu werden. Des Weiteren wurde Pex11pβ sowie dessen beide Isoformen Pex11pα und Pex11pγ untersucht. Pex11-Proteine sind die einzig bekannten Proteine, die im Säuger die Elongation und Proliferation von Peroxisomen induzieren; sie erfüllen daher (vermutlich) eine Schlüsselfunktion in der Regulation der Peroxisomenanzahl. Hier wurde zum ersten Mal eine vergleichende Charakterisierung der Pex11p-Isoformen durchgeführt. Unterschiedlich getaggte und trunkierte Konstrukte wurden generiert und deren Auswirkungen auf die Bildung und Teilung der Peroxisomen untersucht. Bemerkenswert ist, dass die drei Pex11-Proteine (nur) teilweise überlappende Funktionen haben. Durch Pex11pβ induzierte peroxisomale Tubuli segmentieren (bevor sie geteilt werden). Pex11pγ bewirkt ebenfalls die Ausbildung von Tubuli, diese werden allerdings nicht segmentiert. Die Expression von Pex11pα führt hingegen ausschließlich zu einer Segregation der peroxisomalen Proteine. Die beiden unterschiedlichen Funktionen von Pex11pα und Pex11pγ scheinen daher in Pex11pβ vereint zu sein. Zusätzlich zeigen die Pex11-Proteine unterschiedlich starke Sensitivität für das Detergens Triton-X 100, was mit unterschiedlichen Lipid¬binde¬eigen¬schaften zusammenhängen könnte, die wiederum die membran¬deformierenden Fähigkeiten erklären würden. Es wurden zudem unterschiedliche Signale, die zu Elongation von Peroxisomen führen (wie z.B. Mikrotubulidepolymerisation), untersucht und es konnte gezeigt werden, dass multiple Stimuli zu einer Hypertubulation der Peroxisomen führen. Diese wird allerdings nicht durch transkriptionelle Hochregulation der Pex11-Proteine vermittelt. Dies weist darauf hin, dass weitere Proteine eine Elongation von Peroxisomen induzieren können und/oder dass andere regulatorische Prozesse wie z.B. posttranslationale Modifikationen an der Tubulation der Peroxisomen beteiligt sind. Ferner wurde entdeckt, dass das Fusionsprotein Pex11pβ-YFP als spezifisches Werkzeug für die Entschlüsselung früher Ereignisse im Wachstums- und Teilungsprozess der Peroxisomen genutzt werden kann. Pex11pβ-YFP inhibiert die Segmentierung und Teilung der Peroxisomen. Es führt zur Bildung von pre-peroxisomalen Strukturen, die aus globulären Domänen und tubulären Membranfortsätzen aufgebaut sind. Diese Strukturen wurden detailliert charakterisiert. Interessanterweise sind die peroxisomalen Matrix- und Membranproteine in definierten Regionen lokalisiert. Es konnte mit Hilfe von time-course und Importstudien gezeigt werden, dass die von Pex11pβ induzierten Membranfortsätze von schon vorhandenen Peroxisomen ausgehen. Dies zeigt, dass der Wachstums- und Teilungsprozess der Peroxisomen ein mehrschrittiger Reifungsvorgang ist. Die Bildung von Peroxisomen im Säuger ist somit komplexer als die simple Durchschnürung einer existenten Organelle. In dieser Arbeit wurden insbesondere die frühen Schritte des peroxisomalen Wachstums- und Teilungsprozesses erstmals detailliert charakterisiert. Die erzielten Befunde werfen ein neues Licht auf den generellen Prozess der Bildung von Peroxisomen durch Wachstum und Teilung und weisen auf neue, noch nicht charakterisierte Vorgänge (z.B. bei der Proteinsortierung) an der peroxisomalen Membran hin.