The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis

Der dimorphe Hemibasidiomycet Ustilago maydis, Erreger des Maisbeulenbrandes, ist ein Modellorganismus für die Untersuchung biotropher Interaktionen. Die Sekretion von Effektorproteinen ist eine zwingende Voraussetzung für biotrophes Wachstum. Einige der neuen von U. maydis sekretierten Effektoren werden von Genfamilien kodiert, welche möglicherweise redundante Funktionen erfüllen. Bedingt durch die begrenzte Anzahl verfügbarer Selektionsmarker war es bei Beginn dieser Arbeit nicht möglich, sequenzielle Gendeletionen vorzunehmen. Somit war zu diesem Zeitpunkt die funktionelle Analyse dieser Genfamilien nicht möglich. In dieser Arbeit wurde ein induzierbares, FLP-vermitteltes System zur Wiederverwertung von Selektionsmarkern etabliert. Das System beruht auf drei wesentlichen Schritten: Erstens, der Herstellung einer Deletionsmutante in welcher der eingeführte Selektionsmarker von gleichgerichteten FLP-Erkennungsstellen, sogenannten FRT-Sequenzen, flankiert wird. Zweitens, der Einbringung eines für FLP kodierenden Gens unter der Kontrolle eines induzierbaren Promoters, welches auf einem autonom replizierenden Plasmid vorliegt. Drittens, der Induktion der Expression von FLP und die subsequente Überprüfung auf Verlust des Selektionsmarkes und Verlust des FLP-Donorplasmids. Um inter- und intramolekulare Rekombination zwischen nach der Entfernung des Selektionsmarkers im Genom verbliebenen identischen FRT-Sequenzen auszuschließen, wurden FRT-Sequenzen mit unterschiedlichen Punktmutationen in der Kernsequenz verwendet. Die FLP-vermittelte Technik zur Entfernung von Selektionsmarkern wurde erfolgreich verwendet um eine Genfamilie aus elf Effektorgenen (eff1) in fünf aufeinanderfolgenden Rekombinationen zu deletieren. Alle Eff1-Proteine haben einen vergleichbaren Aufbau. Eine N-terminale Signalsequenz ist gefolgt von einem weitgehend unstrukturierten Bereich, an den sich die konservierte C-terminale Domäne anschließt - voraussichtlich der einzige gefaltete Bereich dieser Proteine. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression aller elf Gene während der biotrophen Phase spezifisch hochreguliert wird. Stämme mit Deletionen von neun oder allen elf Genen zeigten einen signifikanten Rückgang der Virulenz. Dieser Phänotyp konnte durch Einbringung verschiedener Gene dieser Genfamilie teilweise komplementiert werden, woraus sich ableiten lässt, dass die entsprechenden Gene redundant sind. Die vorliegenden Untersuchungen zur Deletion und Komplementierung von Mitgliedern der eff1-Genfamilie belegen, dass drei der elf eff1-Gene entscheidend zu der Virulenz von U. maydis beitragen, während der Einfluss der restlichen Genfamilie vernachlässigbar ist.