Chemoenzymatic Synthesis of Chromodepsipeptides and Natural Product Discovery via Genome Mining

Die Entwicklung neuartiger Sequenzierungstechnologien ermöglicht die Identifizierung einer Vielzahl von kryptischen bakteriellen Genclustern, welche an der Biosynthese nichtribosomaler Peptide (NRPs) beteiligt sind. Peptide nichtribosomalen Ursprungs konstituieren eine Klasse strukturell diverser Naturstoffe, welche durch multimodulare Peptidsynthetasen (NRPSs) assembliert werden. Nichtribosomale Peptide weisen ein breites pharmakologisches Spektrum als Antitumor-Wirkstoffe, Antibiotika oder Immunosuppressiva auf. Das eingehende Verständnis der nichtribosomalen Assemblierungsmechanismen, in Kombination mit rationalem genomischen Mining ermöglicht die Identifizierung neuartiger, bioaktiver Verbindungen. Die vorliegende Arbeit umfasst neben der chemoenzymatischen Synthese von Thiocoralin-Analoga die de novo Identifizierung neuer Naturstoffe durch genomisches Mining. Thiocoralin stellt ein makrozyklisches Oktathiodepsipeptid dar, in welchem die mit exozyklischen Chromophoren funktionalisierten Oligopeptide über zwei Thioesterbindungen verbunden sind. In dieser Arbeit wurde das Zyklodimerisierungspotential der Thiocoralin Thioesterase-Domäne (TioS PCP-TE) untersucht, um ein genaueres Verständnis der iterativen Assemblierung der Chinolin- und Chinoxalinchromodepsipeptide zu erhalten. Hierzu wurde das Enzym rekombinant produziert und mit synthetischen, linearen Peptidylsubstratanaloga inkubiert. TioS PCP-TE katalysierte die Zyklodimerisierung der linearen Tetrapeptidylsubstrate unter Ausbildung verschiedener Makrothiolaktone. Die Evaluierung des biokombinatorischen Potentials ergab eine relaxierte Substratspezifität des Enzyms und ermöglichte die Generierung von Chromodepsipeptid-Analoga. Die chemoenzymatisch generierten makrozyklischen Laktone oder Thiolaktone wurden isoliert und auf ihre DNA-Bisinterkalationsaktivität hin untersucht. Im zweiten Teil dieser Arbeit resultierte die bioinformatische Analyse des 8.2 Mb umfassenden Genoms von Saccharopolyspora erythraea in der Identifizierung von zwei kryptischen Hydroxamat-Siderophor NRPS Genclustern. Die Analyse der Adenylierungs-Domänen Substratspezifität und der modularen Organisation ermöglichte die Etablierung eines hochselektiven und hochsensitiven Radio-LCMS-geleiteten genomischen Mining Ansatzes. Die Anwendung dieses Ansatzes resultierte in der Entdeckung des Siderophors Erythrochelin. Die strukturelle Charakterisierung von Erythrochelin wurde mittels NMR-spektroskopischen sowie massenspektrometrischen Studien realisiert und ergab für die Sequenz des Tetrapeptid-Siderophors: α-N-Acetyl-δ-N-acetyl-δ-N-hydroxy-D-Ornithin-D-Serin-zyklo(δ-N-Hydroxy-L-Ornithin-δ-N-Acetyl-δ-N-hydroxy-L-Ornithin). Die Assemblierung von Erythrochelin erfordert die Synthese von δ-N-Hydroxy-L-Ornithin (L-hOrn) und δ-N-Acetyl-δ-N-hydroxy-L-Ornithin (L-haOrn). Zur Untersuchung der korrespondierenden Biosynthesen wurden die FAD-abhängigen Monooxygenasen EtcB und Sace_1309, sowie die bifunktionelle Malonyl-CoA Decarboxylase/N-Acetyltransferase Mcd, identifiziert und biochemisch charakterisiert. Mittels in vitro-Studien wurde gezeigt, dass EtcB und Sace_1309 ausschließlich die δ-N-Hydroxylierung von freiem L-Ornithin katalysieren. Mcd katalysierte die Decarboxylierung von Malonyl-CoA und einen anschließenden Acetyltransfer auf die δ-Hydroxamino Funktionalität von L-hOrn unter Bildung von L-haOrn. Die Aufklärung der Biosynthese des Vorläufermoleküls L-haOrn resultierte in der Postulierung eines umfassenden Modells für die Assemblierung von Erythrochelin.