Characterization of copper mediated transcriptional responses in Bacillus subtilis and Identification of copper and iron connection in Bacillus subtilis.

Kupfer ist ein essentieller Kofaktor für viele Enzyme und über einem Schwellenwert toxisch für alle Organismen. Der Redoxstatus von Kupfer, der zwischen Cu(I) und Cu(II) changiert, ist bedeutungsvoll für die Funktionalität kupferabhängiger Enzyme. Unkontrollierte Akkumulation von Kupfer in der Zelle kann zur Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies und dadurch zu oxidativem Stress führen, der DNA und Proteine schädigt. In dieser Arbeit wurde das Gram-positive Bakterium Bacillus subtilis verwendet, um die Mechanismen zu verstehen, die der Kupferhomöostase zugrunde liegen. Insbesondere wurde der kürzlich identifizierte Transkriptions-Regulator CsoR für den Kupferefflux untersucht. Deletionsmutanten von csoR zeigen einen defektiven Wachstumsphänotyp unter Kupferstress und einen etwas besseres Wachstum unter kupferlimitierenden Bedingungen. Globalexpressionsanalysen von ΔcsoR mittels DNA Microarrays unter Kupferlimitation zeigten eine achtfache Überexpression des ycnJ Gens, das eine wichtige Rolle im Kupfermetabolismus zu spielen schien. Die Deletion von ycnJ zeigte einen Wachstumseffekt unter Kupferlimitation und Kupferstress. Native Gelschift-Experimente mit der rekombinanten N-terminalen Domäne von YcnJ zeigten seine starke Affinität zu Cu(II) Ionen in vitro. Das stromaufwärts von ycnJ gelegene Gen ycnK codiert für einen putativen Transkriptionsfaktor, dessen Deletion eine konstitutive Exprerssion von ycnJ zeigte. Weitere Studien unterstützten die prinzipielle Rolle von YcnJ nicht nur als Kupferimporter unter Kupferlimitationsbedingungen, aber auch als möglicher Kupferresistenzfaktor unter Kupferstress. Weiterhin wurde ein Zusammenhang zwischen Kupfer- und Eisenhomöostase aufgedeckt. Microarray-gestützte globale Expressionsanalysen mit der csoR Mutante zeigten eine jeweils andere Expression von Eisenhomöostasegenen in Anwesenheit oder Abwesenheit von Kupfer. Unterexpression der folgenden Gene wurde beobachtet: 1.) dhbABCEF, die an der Bacillibactin-Produktion beteiligt sind, 2.) feuABC, die für die Aufnahme von eisenbeladenem Bacillibactin verantwortlich sind, 3.) btr und besA, die für die intrazelluläre Perzeption von Bacillibactin zur Regulation der Aufnahme sowie zur Bacillibactinhydrolyse und Eisenfreisetzung notwendig sind. Die Transkriptionsprofile, Quantifizierungen der Bacillibactinmengen und Bestimmungen der Gesamteisen- und Gesamtkupfergehalte im Wildtyp und der csoR Mutante hinsichtlich unterschiedlich angebotener Kupfermengen zeigten einen indirekten Zusammenhang zwischen zellulärem Eisen- und Kupferhaushalt. Zusätzlich zeigte die csoR Mutante eine differenzierte Regulation der Sauerstoffperzeptions-, der Fermentations- und der Cytochromgene unter Kupferstress, was weiterhin auf eine mögliche Rolle von CsoR im Energiehaushalt der Zelle unter unterschiedlichen Sauerstoff-, Eisen- und Kupferkonzentrationen hinweist.